| A Microfluidic Device for Massively Parallel, Whole-lifespan Imaging of Single Fission Yeast Cells
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] Whole-lifespan single-cell analysis has greatly increased our understanding of fundamental cellular processes such as cellular aging. To observe individual cells across their entire lifespan, all progeny must be removed from the growth medium, typically via manual microdissection. However, manual microdissection is laborious, low-throughput, and incompatible with fluorescence microscopy. Here, we describe assembly and operation of the multiplexed-Fission Yeast Lifespan Microdissector (multFYLM), a high-throughput microfluidic device for rapidly acquiring single-cell whole-lifespan imaging. multFYLM captures approximately one thousand rod-shaped fission yeast cells from up to six different genetic backgrounds or treatment regimens. The immobilized cells are fluorescently imaged for over a ...
[摘要] 整个寿命的单细胞分析极大地增加了我们对细胞老化等基本细胞过程的理解。为了观察整个寿命期间的个体细胞，必须从生长培养基中移除所有后代，通常通过手动显微切割。然而，手动显微切割费力，低通量，并且与荧光显微镜不兼容。在这里，我们描述了多路复用裂变酵母寿命显微解剖器（multFYLM）的组装和操作，这是一种用于快速获取单细胞全寿命成像的高通量微流体装置。 multFYLM从多达六种不同的遗传背景或治疗方案中捕获约一千个杆状裂殖酵母细胞。将固定的细胞荧光成像超过一周，而将子代细胞从装置中取出。得到的数据集产生记录每个细胞复制寿命的高分辨率多通道图像。我们预计multFYLM将广泛适用于裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）和其他对称分裂的单细胞生物的单细胞整个寿命研究。
【背景】细胞衰老导致细胞功能的累积下降，最终导致死亡。大多数关于细胞衰老的研究侧重于模型单细胞生物的复制寿命，例如出芽酵母酿酒酵母（Nyström和Liu，2014; Wasko和Kaeberlein，2014; Wierman和Smith，2014; Ruetenik和Barrientos ，2015）。细胞的复制寿命（RLS）被定义为母细胞在其生命过程中产生的女儿的数量（Henderson和Gottschling，2008; Sutphin等人，2014）。 ...
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| Isolation, BODIPY Labeling and Uptake of Exosomes in Hepatic Stellate Cells
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Author:
Date:
2017-12-05
[Abstract] Exosomes have emerged as an important mediator of intercellular communication. They are present in extracellular milieu and therefore, easily accessible by neighboring or distant cells. They carry mRNA, microRNAs and proteins within their vesicles and once internalized by recipient cells; they can modulate multiple signaling pathways with pleiotropic effects from inducing antiviral state to disease progression. We have previously shown that hepatitis C virus (HCV) infected hepatocytes or hepatoma cells harboring genome-length replicon secrete exosomes in culture supernatants. These exosomes are taken up by hepatic stellate cells (HSC) and activate them to induce fibrosis during HCV infection. Here, we describe detailed protocols for exosomes isolation and uptake of BODIPY labeled exosomes ...
[摘要] 外来体已经成为细胞间通讯的重要介质。 它们存在于细胞外环境中，因此可以被邻近或远处的细胞轻易获得。 它们在囊泡内携带mRNA，microRNA和蛋白质，并一度被受体细胞内化; 它们可以通过诱导抗病毒状态向疾病进展调节多种信号传导途径，具有多效性。 我们以前已经显示，携带基因组长度复制子的丙型肝炎病毒（HCV）感染的肝细胞或肝癌细胞在培养上清液中分泌外泌体。 这些外来体被肝星状细胞（HSC）摄取，并在HCV感染期间激活它们以诱导纤维化。 在这里，我们描述了外来体分离和肝星状细胞摄取BODIPY标记的外来体的详细的协议。
【背景】外来体是直径为40-150nm的小的膜结合的细胞外囊泡。已在所有体液中鉴定出它们，包括尿，羊水，血清，唾液，母乳，脑脊液，鼻分泌物和组织培养的细胞系的上清液中。外泌体通过转移微小RNA（mRNA），mRNA和蛋白质来介导细胞与细胞之间的通讯。 其可被邻近或远处的细胞摄取，并随后促进受体细胞中的信号传导（Schorey等人，2015）。外泌体富含蛋白质，包括四跨膜蛋白家族成员（CD9，CD81，CD63），热休克蛋白（Hsp60，Hsp70，Hsp90）和多泡体蛋白（annexins，RabGTPases和内体分选复合物，蛋白质）。最近的研究表明，外来体可以影响免疫应答（Li等人，2013; ...
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| Polyethylene Glycol-mediated Transformation of Drechmeria coniospora
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Author:
Date:
2017-03-05
[Abstract] Drechmeria coniospora is a nematophagous fungus and potential biocontrol agent. It belongs to the Ascomycota. It is related to Hirsutella minnesotensis, another nematophagous fungus but, phylogenetically, it is currently closest to the truffle parasite Tolypocladium ophioglossoides. Together with its natural host, Caenorhabditis elegans, it is used to study host-pathogen interactions. Here, we report a polyethylene glycol-mediated transformation method (Turgeon et al., 2010; Ochman et al., 1988) for this fungus. The protocol can be used to generate both knock-in or knock-out strains (Lebrigand et al., 2016).
[摘要] Drechmeria coniospora 是一种无害真菌和潜在的生物防治剂。它属于子囊菌纲。它与另外一种没食子菌真菌Hirsutella minnesotensis有关，但在系统发育中，它目前最接近松露寄生虫Tolypocladium ophioglossoides 。与其天然宿主，秀丽隐杆线虫一起，它用于研究宿主 - 病原体相互作用。在这里，我们报告了这种真菌的聚乙二醇介导的转化方法（Turgeon等人，2010; Ochman等人，1988）。该方案可用于产生敲入或敲除菌株（Lebrigand等人，2016）。
背景 D。 coniospora 已被开发为用于研究先天免疫的模型病原体。 elegans （Lebrigand等人，2016和其中的参考文献）。 D。 coniospora 在标准生长培养基上缓慢增长，使得体外研究困难，难以开发转化方法。我们在这里报告一种允许快速生产大量的D的文化方法。 coniospora ，开辟了其遗传修饰的道路。聚乙二醇介导的转化可能是广泛应用于修饰真菌的最简单的方法。我们发现它可以与一起使用。 coniospora ，因此提供了故意修改其基因组的第一种方法。
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