| Generation of Targeted Knockout Mutants in Arabidopsis thaliana Using CRISPR/Cas9
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Author:
Date:
2017-07-05
[Abstract] The CRISPR/Cas9 system has emerged as a powerful tool for gene editing in plants and beyond. We have developed a plant vector system for targeted Cas9-dependent mutagenesis of genes in up to two different target sites in Arabidopsis thaliana. This protocol describes a simple 1-week cloning procedure for a single T-DNA vector containing the genes for Cas9 and sgRNAs, as well as the detection of induced mutations in planta. The procedure can likely be adapted for other transformable plant species.
[摘要] CRISPR / Cas9系统已成为植物及其以外基因编辑的强大工具。 我们已经开发了植物载体系统，用于拟南芥中多达两个不同靶位点的基因的目标Cas9依赖性诱变。 该方案描述了对于含有Cas9和sgRNA的基因的单个T-DNA载体的简单的1周克隆程序，以及植物中诱导突变的检测。 该方法可能适用于其他可转化植物物种。
【背景】CRISPR / Cas9系统（Cas9）提供了一种简单且广泛适用的方法来修改感兴趣的基因组区域，因此成为植物和其他生物体基因组编辑的首选工具（Schiml和Puchta，2016）。该系统依赖于可以通过短的人造单指导RNA分子（sgRNA）向基因组DNA序列引导的化脓性链球菌（Cas9）的细菌Cas9核酸酶（Jinek等人， ，2012），在那里它创建一个双链断裂（DSB）。然后通过植物细胞的固有DNA修复机制修复这些DSB。在这里，可以区分两个主要途径（Salomon和Puchta，1998）。 （i）与DSB位点高度同源的DNA分子可用作修复模板。可以利用这种同源性定向修复（HDR）方法在DSB的现场引入特定的序列（Schiml等人，2014; Baltes and Voytas，2015）。然而，由于这些序列的低融合率，植物中HDR介导的基因编辑仍然具有挑战性。 ...
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| Multiplexed GuideRNA-expression to Efficiently Mutagenize Multiple Loci in Arabidopsis by CRISPR-Cas9
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Author:
Date:
2017-03-05
[Abstract] Since the discovery of the CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-associated protein (Cas) as an efficient tool for genome editing in plants (Li et al., 2013; Shan et al., 2013; Nekrasov et al., 2013), a large variety of applications, such as gene knock-out, knock-in or transcriptional regulation, has been published. So far, the generation of multiple mutants in plants involved tedious crossing or mutagenesis followed by time-consuming screening of huge populations and the use of the Cas9-system appeared a promising method to overcome these issues. We designed a binary vector that combines both the coding sequence of the codon optimized Streptococcus pyogenes Cas9 nuclease under the control of the Arabidopsis thaliana ...
[摘要] 自从发现CRISPR（聚集的定期交织的短回文重复） - 相关蛋白（Cas）作为植物基因组编辑的有效工具（Li等人，2013; Shan等人已经出版了诸如基因敲除，敲入或转录调控等各种各样的应用，例如，2013; Nekrasov等人，2013）。到目前为止，植物中多种突变体的产生涉及繁琐的杂交或诱变，随后大量人群的耗时筛选，Cas9系统的使用似乎是有希望的方法来克服这些问题。我们设计了一种二元载体，其结合了在拟南芥UBIQUITIN10（UBQ10）启动子和引导RNA（gRNA）控制下的优化的化脓性链球菌（Caspase）密码子的编码序列）由 A驱动的表现盒。拟南芥U6 - 启动子，用于在拟南芥中进行有效的多重编辑（阎等人，2016年）。在这里，我们描述了一个逐步的方案，以经济有效的方式生成含有多个gRNA的二元载体和基于经典克隆方法的Cas9核酸酶。背景 RNA引导的Cas9系统源于针对外源DNA的细菌防御系统（Sorek等人，2013）。由于其高效率，易于处理和多重编辑的可能性，已经被认为是基因组编辑的选择方法。通常，Cas9基因编辑系统涉及单个合成RNA分子，其指导Cas9蛋白质靶向所需DNA位点以进行基因组修饰或转录控制的gRNA。 gRNA-Cas9复合物通过gRNA-DNA配对识别靶向的DNA，并需要存在原始相邻基序（PAM）。 ...
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