| Liposome Flotation Assay for Studying Interactions Between Rubella Virus Particles and Lipid Membranes
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Author:
Date:
2018-08-20
[Abstract] Rubella virus (RuV) is an enveloped, positive-sense single-stranded RNA virus that is pathogenic to humans. RuV binds to the target cell via the viral envelope protein E1, but the specific receptor molecules on the target cell are yet to be fully elucidated. Here, we describe a protocol for liposome flotation assay to study direct interactions between RuV particles and lipid membranes in a qualitative manner. Interactions are examined by a Nycodenz density gradient fractionation using UV-inactivated RuV particles and fluorescent-labeled liposomes consisting of pure lipids. Fractionated RuV particles are detected using standard sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Western blot analysis for viral proteins. On the Nycodenz gradient, RuV particles ...
[摘要] 风疹病毒（RuV）是一种包膜的正义单链RNA病毒，对人类具有致病性。 RuV通过病毒包膜蛋白E1与靶细胞结合，但靶细胞上的特异性受体分子尚未完全阐明。在这里，我们描述了脂质体浮选测定的方案，以定性方式研究RuV颗粒和脂质膜之间的直接相互作用。使用UV-灭活的RuV颗粒和由纯脂质组成的荧光标记的脂质体通过Nycodenz密度梯度分级检查相互作用。使用标准十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测分级的RuV颗粒，然后对病毒蛋白进行Western印迹分析。在Nycodenz梯度上，与未结合的RuV颗粒相比，与脂质体结合的RuV颗粒转移至较低密度的部分。使用该方案，我们提供了令人信服的证据，即在中性pH下以钙依赖性方式，RuV颗粒与某些细胞类型中含有鞘磷脂（SM）和胆固醇的脂质膜结合。
【背景】 风疹病毒是“风疹”的致病因子，“风疹”是一种急性且相对轻微的全身性感染和“先天性风疹综合征”，一种导致严重出生缺陷的转胎胎儿感染（Hobman，2013）。阐明RuV进入的分子机制对于了解病毒病理学和帮助开发抗RuV药物是必不可少的。虽然以前的研究表明宿主细胞的膜脂质作为RuV受体（Mastromarino et al。，1989和1990; DuBois et ...
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| Liposome Flotation Assays for Phosphoinositide-protein Interaction
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Author:
Date:
2017-03-05
[Abstract] Phosphoinositides are rare membrane lipids involved in the control of the major cellular functions and signaling pathways. They are able to recruit specific effector proteins to the cytosolic face of plasma membrane and organelles to coordinate a vast variety of signaling and trafficking processes, as well to maintain specific identity of the different subcellular compartments (Di Paolo and De Camilli, 2006; Lemmon, 2003). Therefore, analysis of these effectors’ binding properties and specificity towards different phosphoinositides is crucial for the understanding of their cellular functions. This protocol describes a method to characterize the binding of proteins to different phosphoinositide-containing vesicles.
[摘要] 磷酸肌醇是涉及控制主要细胞功能和信号通路的稀有膜脂质。他们能够将特异性效应物蛋白募集到质膜和细胞器的胞质表面，以协调各种信号传递和转运过程，并保持不同亚细胞区室的特定身份（Di Paolo和De Camilli，2006; Lemmon， 2003）。因此，这些效应物对不同磷酸肌醇的结合特性和特异性的分析对于了解其细胞功能至关重要。该方案描述了表征蛋白质与不同含磷酸肌醇的囊泡结合的方法。
背景 分析蛋白质 - 磷酸肌醇结合和对磷酸肌醇家族不同成员的特异性的几种方法：脂质覆盖，脂质浮选测定和表面等离子体共振（SPR）。脂质浮选测定法包括将单层囊泡与目的蛋白质孵育，随后在蔗糖垫上浮选囊泡，其将单独的囊泡结合的蛋白质与未结合的蛋白质和囊泡分离。与其他方法相比，脂质浮选测定是i）在技术上比SPR更容易和更便宜，ii）与蛋白质重叠测定相比，更具体和更接近于生理条件，因为它模拟膜的曲率，其中脂质被干燥平的硝酸纤维素膜。该方案描述了重组GST标记的蛋白质与确定大小和脂质组成的单层囊泡的结合，特别是关于对不同单磷酸化磷酸肌醇（PIP）的特异性。
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