|
Author:
Date:
2017-03-05
[Abstract] The incorporation of the CRISPR/Cas9 bacterial immune system into the genetic engineering toolbox has led to the development of several new methods for genome manipulation (Auer et al., 2014; Byrne et al., 2015). We took advantage of the ability of Cas9 to generate blunt-ended double-strand breaks (Jinek et al., 2012) to introduce exogenous DNA in a highly precise manner through the exploitation of non-homologous end-joining DNA repair machinery (Geisinger et al., 2016). This protocol has been successfully applied to traditional immortalized cell lines and human induced pluripotent stem cells. Here we present a generalized protocol for knock-in blunt ligation, using HEK293 cells as an example.
[摘要] 将CRISPR / Cas9细菌免疫系统并入基因工程工具箱已经导致了几种用于基因组操作的新方法的开发（Auer等人，2014; Byrne等人，2015）。我们利用Cas9产生平端双链断裂的能力（Jinek等人，2012），以高度精确的方式通过开发非同源末端引物来引入外源DNA，加入DNA修复机械（Geisinger等人，2016）。该方案已成功应用于传统的永生化细胞系和人诱导多能干细胞。在这里，我们提出了使用HEK293细胞作为例子的敲入钝性连接的一般化方案。
背景 当我们概念化敲门钝性结扎（Geisinger等人，2016）时，开发用于CRISPR / Cas9的绝大多数方法都集中在提高同源重组的效率。然而，有一个例外：在斑马鱼中开发的同源性独立的基于质粒的敲入方法（Auer等人，2014）。这种方法，如敲入钝性连接，依赖于典型的非同源末端连接的机制，以线性化的，平端的双链DNA片段以高精度插入到基因组双链断裂中，核苷酸损失最小。这两种方法类似于为锌指核酸酶和被称为专性连接门控重组的TALEN开发的方法（ObLiGaRe; Maresca等人，2013），其依赖于产生相容的突出端以促进将靶DNA插入基因组。 ...
|