| Single-step Precision Genome Editing in Yeast Using CRISPR-Cas9
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] Genome modification in budding yeast has been extremely successful largely due to its highly efficient homology-directed DNA repair machinery. Several methods for modifying the yeast genome have previously been described, many of them involving at least two-steps: insertion of a selectable marker and substitution of that marker for the intended modification. Here, we describe a CRISPR-Cas9 mediated genome editing protocol for modifying any yeast gene of interest (either essential or nonessential) in a single-step transformation without any selectable marker. In this system, the Cas9 nuclease creates a double-stranded break at the locus of choice, which is typically lethal in yeast cells regardless of the essentiality of the targeted locus due to inefficient non-homologous end-joining ...
[摘要] 芽殖酵母中的基因组修饰已经非常成功，主要归功于其高度同源性的DNA修复机制。之前已经描述了几种用于修饰酵母基因组的方法，其中许多方法涉及至少两个步骤：插入选择标记并用该标记取代预期的修饰。在这里，我们描述了CRISPR-Cas9介导的基因组编辑方案，用于在没有任何选择标记的情况下在单步转化中修饰任何感兴趣的酵母基因（基本或非必需）。在该系统中，Cas9核酸酶在选择的基因座处产生双链断裂，这在酵母细胞中通常是致死的，而不管由于无效的非同源末端连接修复导致的靶基因座的重要性。该致死性通过使用源自PCR的修复模板的同源重组导致有效的修复。在涉及必需基因的情况下，用功能性等位基因编辑基因组病变的必要性作为额外的选择层。作为一个激励性的例子，我们描述了使用这种策略替代HEM2，一种必需的酵母基因，以及相应的人类直向同源物ALAD。
【背景】酿酒酵母（Baccharomyces cerevisiae，Baker's酵母）作为一种遗传易处理的生物体具有悠久的历史，并且有许多操作酵母基因组的方法。然而，直到最近，有必要应用选择以分离具有所需遗传改变的克隆（Kearse等人，2012; DiCarlo等人，2013; Lee等人，等，2015; ...
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| Polyethylene Glycol-mediated Transformation of Drechmeria coniospora
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Author:
Date:
2017-03-05
[Abstract] Drechmeria coniospora is a nematophagous fungus and potential biocontrol agent. It belongs to the Ascomycota. It is related to Hirsutella minnesotensis, another nematophagous fungus but, phylogenetically, it is currently closest to the truffle parasite Tolypocladium ophioglossoides. Together with its natural host, Caenorhabditis elegans, it is used to study host-pathogen interactions. Here, we report a polyethylene glycol-mediated transformation method (Turgeon et al., 2010; Ochman et al., 1988) for this fungus. The protocol can be used to generate both knock-in or knock-out strains (Lebrigand et al., 2016).
[摘要] Drechmeria coniospora 是一种无害真菌和潜在的生物防治剂。它属于子囊菌纲。它与另外一种没食子菌真菌Hirsutella minnesotensis有关，但在系统发育中，它目前最接近松露寄生虫Tolypocladium ophioglossoides 。与其天然宿主，秀丽隐杆线虫一起，它用于研究宿主 - 病原体相互作用。在这里，我们报告了这种真菌的聚乙二醇介导的转化方法（Turgeon等人，2010; Ochman等人，1988）。该方案可用于产生敲入或敲除菌株（Lebrigand等人，2016）。
背景 D。 coniospora 已被开发为用于研究先天免疫的模型病原体。 elegans （Lebrigand等人，2016和其中的参考文献）。 D。 coniospora 在标准生长培养基上缓慢增长，使得体外研究困难，难以开发转化方法。我们在这里报告一种允许快速生产大量的D的文化方法。 coniospora ，开辟了其遗传修饰的道路。聚乙二醇介导的转化可能是广泛应用于修饰真菌的最简单的方法。我们发现它可以与一起使用。 coniospora ，因此提供了故意修改其基因组的第一种方法。
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