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Author:
Date:
2017-03-05
[Abstract] Phosphoinositides are rare membrane lipids involved in the control of the major cellular functions and signaling pathways. They are able to recruit specific effector proteins to the cytosolic face of plasma membrane and organelles to coordinate a vast variety of signaling and trafficking processes, as well to maintain specific identity of the different subcellular compartments (Di Paolo and De Camilli, 2006; Lemmon, 2003). Therefore, analysis of these effectors’ binding properties and specificity towards different phosphoinositides is crucial for the understanding of their cellular functions. This protocol describes a method to characterize the binding of proteins to different phosphoinositide-containing vesicles.
[摘要] 磷酸肌醇是涉及控制主要细胞功能和信号通路的稀有膜脂质。他们能够将特异性效应物蛋白募集到质膜和细胞器的胞质表面，以协调各种信号传递和转运过程，并保持不同亚细胞区室的特定身份（Di Paolo和De Camilli，2006; Lemmon， 2003）。因此，这些效应物对不同磷酸肌醇的结合特性和特异性的分析对于了解其细胞功能至关重要。该方案描述了表征蛋白质与不同含磷酸肌醇的囊泡结合的方法。
背景 分析蛋白质 - 磷酸肌醇结合和对磷酸肌醇家族不同成员的特异性的几种方法：脂质覆盖，脂质浮选测定和表面等离子体共振（SPR）。脂质浮选测定法包括将单层囊泡与目的蛋白质孵育，随后在蔗糖垫上浮选囊泡，其将单独的囊泡结合的蛋白质与未结合的蛋白质和囊泡分离。与其他方法相比，脂质浮选测定是i）在技术上比SPR更容易和更便宜，ii）与蛋白质重叠测定相比，更具体和更接近于生理条件，因为它模拟膜的曲率，其中脂质被干燥平的硝酸纤维素膜。该方案描述了重组GST标记的蛋白质与确定大小和脂质组成的单层囊泡的结合，特别是关于对不同单磷酸化磷酸肌醇（PIP）的特异性。
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