| Tagged Highly Degenerate Primer (THDP)-PCR for Community Analysis of Methane- and Ammonia-oxidizing Bacteria Based on Copper-containing Membrane-bound Monooxygenases (CuMMO)
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] We describe a two-step PCR strategy using tagged highly degenerate primer (THDP-PCR) targeting copper-containing membrane-bound monooxygenases (CuMMO) genes for community analysis of methane- or ammonia-oxidizing bacteria. This strategy consists of a primary CuMMO gene-specific PCR followed by a secondary PCR with a tag as a single primer. This strategy remarkably increases the divergence of CuMMO gene amplicons while maintaining PCR efficiency without obvious amplification bias. This THDP-PCR strategy can be extended to other functional gene-based community analysis with design of new highly degenerate primer covering target functional gene sequences.
[摘要] 我们描述了使用标记的高度简并引物（THDP-PCR）的靶向含铜膜结合单加氧酶（CuMMO）基因进行甲烷或氨氧化细菌的社区分析的两步PCR策略。 该策略由初级CuMMO基因特异性PCR组成，随后是标签作为单一引物的二次PCR。 这种策略显着增加了CuMMO基因扩增子的分歧，同时保持了PCR效率，而没有明显的放大偏差。 这种THDP-PCR策略可以扩展到其他基于功能的基于基因的社区分析，并设计了覆盖目标功能基因序列的新的高度简并引物。
【背景】CuMMO超家族中的基因类型是不同的，现有的引物组只能覆盖一些CuMMO类型（Tuomivirta等，2009）。 为了覆盖CuMMO超家族中不同类型的基因，高度退化的引物是不可避免的，但是当应用于环境样品时，使用高度简并引物的以前策略具有局限性，如低PCR效率或非特异性扩增（Ledeker和De Long，2013）。 我们最近采用了两步PCR PCR方法，标记的高度简并引物，命名为THDP-PCR，扩增了CuMMO家族中广泛的基因，其PCR效率令人满意，没有明显的放大偏差（Wang et al。，2017）。
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| Targeted Mutagenesis Using RNA-guided Endonucleases in Mosses
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] RNA-guided endonucleases (RGENs) have been used for genome editing in various organisms. Here, we demonstrate a simple method for performing targeted mutagenesis and genotyping in a model moss species, Physcomitrella patens, using RGENs. We also performed targeted mutagenesis in a non-model moss, Scopelophilla cataractae, using a similar method (Nomura et al., 2016), indicating that this experimental system could be applied to a wide range of mosses species.
[摘要] RNA引导的核酸内切酶（RGENs）已被用于各种生物体的基因组编辑。 在这里，我们展示了使用RGENs在模型苔藓种类小立碗藓中进行定向诱变和基因分型的简单方法。 我们还使用类似的方法（Nomura等，2016）在非模型苔藓，Scopelophilla白内障中进行了定向诱变，表明该实验系统可以应用于广泛的苔藓物种。
【背景】使用来自适应性免疫系统的RNA引导内切核酸酶（RGEN）的靶向诱变，使用细菌CRISPR（定期间隔的回文重复序列）/ Cas（CRISPR相关）系统近年来已经急剧发展。在该方法中，使用源自化脓性链球菌的Cas9核酸内切酶和人工设计的单链导向RNA（sgRNA）。 Cas9-sgRNA复合物识别原始相邻基序（5'-NGG-3'），并在目标位点上游3 bp切割（Jinek等，2012）。随后，在DNA的双链断裂（DSB）修复过程中发生随机插入和/或缺失突变。使用这些RGEN的定向诱变是有效的以及成本和时间有效的，它已被用于各种生物体（包括许多植物物种）的基因组编辑。在这里，我们在青苔中建立了使用RGEN进行靶向诱变的方案，并在模型和非模型物种中进行了证明（Nomura等，2016）。
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| Targeted Nucleotide Substitution in Mammalian Cell by Target-AID
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Author:
Date:
2017-06-05
[Abstract] Programmable RNA-guided nucleases based on CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated protein) systems have been applied to various type of cells as powerful genome editing tools. By using activation-induced cytidine deaminase (AID) in place of the nuclease activity of the CRISPR/Cas9 system, we have developed a genome editing tool for targeted nucleotide substitution (C to T or G to A) without donor DNA template (Figure 1; Nishida et al., 2016). Here we describe the detailed method for Target-AID to perform programmable point mutagenesis in the genome of mammalian cells. A specific method for targeting the hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HPRT) gene in Chinese Hamster Ovary (CHO) cell was described here as an ...
[摘要] 基于CRISPR的可编程RNA引导核酸酶（集群定期交织的短回文重复）-Cas（CRISPR相关蛋白）系统已被应用于各种类型的细胞作为强大的基因组编辑工具。通过使用激活诱导的胞苷脱氨酶（AID）代替CRISPR / Cas9系统的核酸酶活性，我们开发了一种用于靶向核苷酸替代（C至T或G至A）的基因组编辑工具，无供体DNA模板（图1 ; Nishida等人，2016）。这里我们描述Target-AID在哺乳动物细胞基因组中进行可编程点突变的详细方法。在这里描述了用于靶向中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中的次黄嘌呤 - 鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HPRT）基因的具体方法作为实例，而该方法主要应适用于任何感兴趣的基因广泛的细胞类型。
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图1. Target-AID及其可靶向位点的示意图。在指导RNA（gRNA）依赖性方式中，通过接头与nCas9（D10A）融合的PmCDA1在-21周围进行可编程胞苷突变至相对于哺乳动物细胞中非互补链上的PAM序列的-16位。可目标地点是根据以前的工作中观察到的有效的基础替代（> 20％）来确定的。
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