| Pollen Germination and Pollen Tube Growth of Arabidopsis thaliana: In vitro and Semi in vivo Methods
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Author:
Date:
2018-08-20
[Abstract] Studies of pollen germination and post-germination development are not only essential for understanding plant reproduction but also are an excellent model system for tip-based growth. Here we describe easy, reproducible methods for germination and growth of pollen from the model plant Arabidopsis thaliana in artificial conditions. Our growth system can be used both for pollen placed directly on this artificial substrate as well as for the so-called ‘semi in vivo’ method. This is where a pistil is cut shortly after hand-pollination and the pollen tubes grow through the plant tissue and emerge from the cut end onto the surface of the artificial medium.
[摘要] 花粉萌发和萌发后发育的研究不仅对于理解植物繁殖是必不可少的，而且也是用于尖端生长的优秀模型系统。 在这里，我们描述了简单，可重复的方法，用于在人工条件下从模式植物拟南芥中萌发和生长花粉。 我们的生长系统既可用于直接置于该人工基质上的花粉，也可用于所谓的“半体内”方法。 这是在手动授粉后不久切割雌蕊并且花粉管通过植物组织生长并从切割末端出现在人工培养基表面上的地方。
【背景】 开花植物的花粉被广泛用作快速，尖端生长的模型系统。当然，花粉生物学的研究对于了解植物的生育力和生殖发育也是必不可少的。然而，一种简单可靠的方法是从模式植物拟南芥中萌发花粉并在体外维持快速，形态正常的花粉管生长令人沮丧地难以捉摸。在开发我们自己的方法（Rodriguez-Enriquez et al。，2013）之前，我们尝试复制几种已发表的方法，但经过多次尝试后，我们未能产生令人满意的结果。例如，在实验室中复制Boavida和McCormick的方法很困难，因为它具有非常窄的温度最佳值（22°C），这种情况显然不能反映 A的生殖生物学。拟南芥（Boavida和McCormick，2007）。此外，在该方法中存在发芽率和局部花粉密度的问题，其也不完全反映在柱头表面上的自然事件。我们的第一个线索是，体外可靠的花粉萌发所需的关键“缺失因子”来自观察到放置 ...
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| Detection of Protein Interactions in the Cytoplasm and Periplasm of Escherichia coli by Förster Resonance Energy Transfer
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Author:
Date:
2018-01-20
[Abstract] This protocol was developed to qualitatively and quantitatively detect protein-protein interactions in Escherichia coli by Förster Resonance Energy Transfer (FRET). The described assay allows for the previously impossible in vivo screening of periplasmic protein-protein interactions. In FRET, excitation of a donor fluorescent molecule results in the transfer of energy to an acceptor fluorescent molecule, which will then emit light if the distance between them is within the 1-10 nm range. Fluorescent proteins can be genetically encoded as fusions to proteins of interest and expressed in the cell and therefore FRET protein-protein interaction experiments can be performed in vivo. Donor and acceptor fluorescent protein fusions are constructed for bacterial proteins ...
[摘要] 该协议的开发是通过Förster共振能量转移（FRET）定性和定量检测大肠杆菌中的蛋白质 - 蛋白质相互作用。所描述的测定允许以前不可能的周质蛋白质 - 蛋白质相互作用的体内筛选。在FRET中，供体荧光分子的激发导致能量转移到受体荧光分子，如果它们之间的距离在1-10nm范围内，则受体荧光分子将发光。荧光蛋白质可以被遗传编码为与感兴趣的蛋白质的融合物并且在细胞中表达，因此FRET蛋白质 - 蛋白质相互作用实验可以在体内进行。供体和受体荧光蛋白融合体被构建用于被怀疑相互作用的细菌蛋白质。这些融合蛋白在细菌细胞中共表达，随后激发供体和受体通道测量荧光发射光谱。供体的发射光谱与受体的激发光谱之间的部分重叠是FRET的先决条件。即使在没有FRET的情况下，供体激发也可以使受体以已知百分比交叉激发。通过测量背景，仅供体和仅受体样品的参考光谱，可以计算预期的发射光谱。在预期光谱之上的受体的致敏发射可以归因于FRET，并且可以通过光谱解混来量化。
【背景】确定如何和哪些蛋白质相互作用维持生命是分子生物学研究的核心。存在许多体外方法，但可能导致误报，因为相互作用是从其生物学背景中取出的。 ...
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| Plasma Membrane Preparation from Lilium davidii and Oryza sativa Mature and Germinated Pollen
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Author:
Date:
2017-05-20
[Abstract] Pollen germination is an excellent process to study cell polarity establishment. During this process, the tip-growing pollen tube will start elongating. The plasma membrane as the selectively permeable barrier that separates the inner and outer cell environment plays crucial roles in this process. This protocol described an efficient aqueous polymer two-phase system followed by alkaline solution washing to prepare Lilium davidii or Oryza sativa plasma membrane with high purity.
[摘要] 花粉萌发是研究细胞极性的一个很好的过程。在此过程中，尖端生长的花粉管将开始延长。作为分离内外细胞环境的选择性渗透屏障的质膜在该过程中起关键作用。该方案描述了一种有效的含水聚合物两相体系，接着进行碱性溶液洗涤以制备高纯度的百合百合或水稻质膜。
背景 花粉质膜包含对花粉管生长和受精至关重要的各种蛋白质，例如受体样激酶（Wang等人，2016）和离子通道（Hamilton等人， em>，2015）。分离纯质膜（PM）是综合PM蛋白质组分析的前提。 PM制备主要有四种方法：差速离心，密度梯度离心，制备型自由流动电泳和含水聚合物两相体系。通常，差速离心通常与密度梯度离心合并，以根据其大小，形状和密度分离亚细胞组分。这种技术是快速的，但是由于细胞器密度的重叠，所得的PM产率和纯度都很低（Schindler和Nothwang，2006）。自由流动电泳和水性聚合物两相系统根据其表面性质分离膜囊泡。这两种方法可以富集PM足够纯化蛋白质组学分析（Alexandersson等人，2007）。然而，用于自由流动电泳的仪器操作复杂（Sandelius等人，1986）。相比之下，通过离心可以容易且快速地进行含水聚合物两相体系，使得该方法对PM制备更方便。 ...
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