| Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) for Studying Sarcomeric Protein Interactions in Drosophila
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Author:
Date:
2020-04-05
[Abstract] Protein-protein interactions in Drosophila myofibrils are essential for their function and formation. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is an effective method for studying protein interactions and localization. BiFC relies on the reconstitution of a monomeric fluorescent protein from two half-fragments when in proximity. Two proteins tagged with the different half-fragments emit a fluorescent signal when they are in physical contact, thus revealing a protein interaction and its spatial distribution. Because myofibrils are large networks of interconnected proteins, BIFC is an ideal method to study protein-protein interactions in myofibrils. Here we present a protocol for generating transgenic flies compatible with BiFC and a method for analyzing protein-protein ...
[摘要] [摘要] 果蝇肌原纤维中的蛋白质-蛋白质相互作用对其功能和形成至关重要。双分子荧光互补（BiFC ）是研究蛋白质相互作用和定位的一种有效方法。BiFC 依赖于邻近时从两个半片段重构单体荧光蛋白。标记有不同半片段的两种蛋白质在物理接触时会发出荧光信号，从而揭示了蛋白质相互作用及其空间分布。因为肌原纤维相互连接的蛋白质的大型网络中，附设是一种理想的方法来 研究肌原纤维中蛋白质之间的相互作用。在这里，我们提出了一种生成与BiFC 兼容的转基因果蝇的协议，以及一种基于肌原纤维中荧光BiFC 信号的蛋白质-蛋白质相互作用分析方法。我们的方案适用于大多数果蝇蛋白，只需稍加修改即可用于研究任何组织。
[背景] 肉瘤是横纹肌中最小的收缩单位，并沿着肌原纤维的长度以重复的方式延伸（Reedy和Beall，1993）。肉瘤产生肌肉收缩的能力取决于两个肌原纤维成分：细丝和粗丝。肌球蛋白粗丝固定在肌节中心的M线，而肌动蛋白细丝固定在肌节两侧的Z盘上。因此，Z盘对于维持肌原纤维的结构和收缩至关重要，而Z盘无法形成可能导致各种人类肌病的严重缺陷性肌肉表型（Lemke和Schnorrer，2017年）。
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| In vivo Analysis of Cyclic di-GMP Cyclase and Phosphodiesterase Activity in Escherichia coli Using a Vc2 Riboswitch-based Assay
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Author:
Date:
2018-03-05
[Abstract] Cyclic di-guanosine monophosphate (c-di-GMP) is a ubiquitous second messenger that regulates distinct aspects of bacterial physiology. It is synthesized by diguanylate cyclases (DGCs) and hydrolyzed by phosphodiesterases (PDEs). To date, the activities of DGC and PDE are commonly assessed by phenotypic assays, mass spectrometry analysis of intracellular c-di-GMP concentration, or riboswitch-based fluorescent biosensors. However, some of these methods require cutting-edge equipment, which might not be available in every laboratory. Here, we report a new simple, convenient and cost-effective system to assess the function of DGCs and PDEs in E. coli. This system utilizes the high specificity of a riboswitch to c-di-GMP and its ability to regulate the expression of a downstream ...
[摘要] 环状二磷酸鸟苷（c-di-GMP）是一种无处不在的第二信使，它调节细菌生理学的不同方面。 它由diguanylate环化酶（DGC）合成并被磷酸二酯酶（PDE）水解。 迄今为止，通常通过表型分析，细胞内c-di-GMP浓度的质谱分析或基于核糖开关的荧光生物传感器来评估DGC和PDE的活性。 但是，其中一些方法需要尖端设备，而这些设备可能不适用于每个实验室。 在这里，我们报告了一个新的简单，方便和具有成本效益的系统，用于评估E中DGC和PDE的功能。大肠杆菌。 该系统利用核糖开关对c-di-GMP的高特异性及其响应于c-di-GMP浓度而调节下游β-半乳糖苷酶报道基因的表达的能力。 在该协议中，我们描述了该系统的构建及其用于评估DGC和PDE酶的活性。
【背景】Cyclic-di-GMP是细菌中重要且无处不在的第二信使，其调节各种过程，例如运动到衰退转变，生物膜形成，毒力和细胞周期进展（Römling等人， ，2013）。 GG（D / ...
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| In vitro Co-culture of Mesenchymal Stem Cells and Endothelial Colony Forming Cells
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Author:
Date:
2017-10-20
[Abstract] The discovery of endothelial colony forming cells (ECFCs) with robust self-renewal and de novo vessel formation potentials suggests that ECFCs can be an excellent cell source for cardiovascular diseases treatment through improving neovascularization in the ischemic tissues. However, their engraftment after transplantation resulted to be low. Previous studies showed mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) could improve the survival and capillary formation capacity of ECFCs in co-culture systems. In this article, we describe a protocol for in vitro co-culture of MSCs and ECFCs to prime ECFCs for better engraftment.
[摘要] 发现具有强大自我更新和从头血管形成潜力的内皮细胞集落形成细胞（ECFCs）表明，ECFC可以通过改善缺血组织的新生血管形成，成为心血管疾病治疗的优良细胞来源。 然而，移植后的移植导致了低位移植。 以前的研究显示间充质干/基质细胞（MSC）可以改善共培养系统中ECFCs的存活和毛细管形成能力。 在这篇文章中，我们描述了体外协调MSCs和ECFCs共同培养ECFC以实现更好的移植。
【背景】内皮祖细胞（EPC）被定义为能够通过血管发生过程形成新血管的细胞群。 2004年，Ingram等人鉴定了来自人脐带血的称为“内皮细胞集落形成细胞（ECFC）”的离体培养物中的特异性高度增殖的EPC群体Ingram等人，2004），并且这些细胞最近被宣布代表EPCs（Medina等人，2017）。类似的群体也可以从具有等效血管化潜力和临床相关数量的人类胎盘组织中分离（Patel等人，2013; Shafiee等人，2015） ）。因此，ECFC移植已被提出作为缺血性疾病如心肌梗塞或关键性腿部缺血的治疗方法。然而，移植后的ECFCs植入物和血管生成潜力被证明是低的（Shafiee等人，2017; ...
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