| Auxin-mediated Protein Degradation in Caenorhabditis elegans
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Author:
Date:
2020-04-20
[Abstract] The auxin-inducible degron (AID) technology was recently adapted for use in the nematode Caenorhabditis elegans. Rapid degradation of C. elegans proteins tagged with an AID is mediated by a plant-specific F-box protein, transport inhibitor response 1 (TIR1), and occurs only in the presence of the phytohormone auxin. The first iteration of this technology elicited protein degradation in C. elegans through a naturally occurring form of auxin, indole-3-acetic acid (IAA). Here, we present a protocol that uses 1-naphthaleneacetic acid, potassium salt (K-NAA), an indole-free synthetic auxin analog. At equal concentration, K-NAA is as effective as IAA in standard nematode growth media (NGM). K-NAA is also effective in physiological buffer (M9), allowing for ...
[摘要] [摘要 ] 植物生长素诱导的德隆（AID）技术最近被用于线虫秀丽隐杆线虫。带有AID标签的秀丽隐杆线虫蛋白的快速降解是由植物特异性F-box蛋白介导的，转运抑制剂反应1 （TIR1），而且只发生在存在的植物激素生长素。第一次迭代的这项技术引起蛋白质降解C. 线虫通过一个天然存在形式的生长素，吲哚-3-乙酸（IAA）。在此，我们协议用途1-萘乙酸，钾盐（K-NAA），一个，自由吲哚合成的植物生长素类似物。在相等浓度 ，K-NAA在标准线虫生长培养基（NGM）中与IAA一样有效。K-NAA在生理缓冲液（M9）中也有效，可以进行高通量实验。K-NAA的主要优点有两个：它的光稳定性可防止光诱导的化合物在储存过程中降解以及在活细胞的荧光显微镜检查过程中产生有毒的吲哚衍生物;其次，其水溶性消除了使用乙醇溶解植物生长素化合物（一种可能混淆C 的溶剂）的需要。线虫寿命和行为分析。在这个协议中，我们描述方法降解菌的C. elegans的使用K-NAA对固体和液体介质的蛋白质，以及我们的方法分析蛋白质降解。
[背景 ] 有条件的蛋白质降解通过降解决定子是一个新兴的方法研究蛋白质功能在秀丽隐杆线虫（拔头筹而Frokjaer -詹森2019年）。现在的降解决定子的方法包括ZF1 （Armenti 等人。2014年，萨累。等，2018） ，生长素诱导型德龙（AID）（Zhang ...
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| Preparation of Precisely Oriented Cryosections of Undistorted Drosophila Wing Imaginal Discs for High Resolution Confocal Imaging
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] The combination of immunofluorescence and laser scanning confocal microscopy (LSM) is essential to high-resolution detection of molecular distribution in biological specimens. A frequent limitation is the need to image deep inside a tissue or in a specific plane, which may be inaccessible due to tissue size or shape. Recreating high-resolution 3D images is not possible because the point-spread function of light reduces the resolution in the Z-axis about 3-fold, compared to XY, and light scattering obscures signal deep in the tissue. However, the XY plane of interest can be chosen if embedded samples are precisely oriented and sectioned prior to imaging (Figure 1). Here we describe the preparation of frozen tissue sections of the Drosophila wing imaginal disc, which allows us to ...
[摘要] 免疫荧光和激光扫描共聚焦显微镜（LSM）的组合是高分辨率检测生物样品中分子分布的关键。频繁的限制是需要在组织内或在特定的平面深处进行成像，这可能由于组织大小或形状而不可接近。因为与XY相比，光的点扩散函数将Z轴的分辨率降低了约3倍，并且光散射使组织中的深层信号模糊，所以不可能重新创建高分辨率3D图像。然而，如果嵌入的样品在成像之前被精确地定向和切片，则可以选择感兴趣的XY平面（图1）。在这里，我们描述的果蝇翅成像光盘的冰冻组织切片的准备，这使得我们能够获得高分辨率的图像，在整个这个折叠上皮的深度。
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图1.上皮结构和未畸变的折叠模式在发育果蝇翅膀的这个冰冻部分的整个深度中都被揭示出来。通过机翼囊横向背腹节。 A.冷冻切片显示贯穿上皮深度的信号的α-连环蛋白（A'，A“，洋红色）的细胞核（A，绿色）和亚细胞分布。基底表面清晰可辨（箭头）。 A是“A的数字增强图像”。 B.在显示为XZ正交视图的自顶向下视图中收集的图像的Z-堆叠揭示了α-连环蛋白（B'，B“）甚至数字增强图像（B”）的细胞核（B）但很少可辨别的细节。未能揭示基底上皮表面（箭头）。 ...
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| In vitro Detection of Neutrophil Traps and Post-attack Cell Wall Changes in Candida Hyphae
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Author:
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2017-04-05
[Abstract] In this protocol we describe how to visualize neutrophil extracellular traps (NETs) and fungal cell wall changes in the context of the coculture of mouse neutrophils with fungal hyphae of Candida albicans. These protocols are easily adjusted to test a wide array of hypotheses related to the impact of immune cells on fungi and the cell wall, making them promising tools for exploring host-pathogen interactions during fungal infection.
[摘要] 在本协议中，我们描述了如何在小鼠嗜中性粒细胞与真菌白色念珠菌的真菌菌丝共培养的背景下观察嗜中性粒细胞胞外捕获物（NETs）和真菌细胞壁变化。 这些方案很容易调整，以测试与免疫细胞对真菌和细胞壁的影响有关的各种假设，使其成为探索真菌感染期间宿主病原体相互作用的有前景的工具。
C。白色念珠菌是一种多态性机会性酵母，嗜中性粒细胞是免疫细胞，对于这种和其他真菌病原体的防御至关重要（Brown等，2012; Lionakis和Netea，2013）。 NETs是可以针对病原体部署的潜在防御机制，并且已经表明它们优先针对诸如C的微生物细胞部署。白念珠菌菌丝太大而不能吞噬（Urban et al。，2006; Bruns等人，2010; Branzk等人，，2014; Rohm等人，2014）。 NET已经显示含有许多组分，包括髓过氧化物酶，胞外DNA和瓜氨酸化的组蛋白（Amulic等人，2012; ...
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