| Expression, Purification and Crystallisation of the Adenosine A2A Receptor Bound to an Engineered Mini G Protein
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Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] G protein-coupled receptors (GPCRs) promote cytoplasmic signalling by activating heterotrimeric G proteins in response to extracellular stimuli such as light, hormones and nucleosides. Structure determination of GPCR–G protein complexes is central to understanding the precise mechanism of signal transduction. However, these complexes are challenging targets for structural studies due to their conformationally dynamic and inherently transient nature. We recently developed an engineered G protein, mini-Gs, which addressed these problems and allowed the formation of a stable GPCR–G protein complex. Mini-Gs facilitated the structure determination of the human adenosine A2A receptor (A2AR) in its G protein-bound conformation at 3.4 Å resolution. ...
[摘要] G蛋白偶联受体（GPCR）通过激活异源三聚体G蛋白来响应细胞外刺激如光，激素和核苷来促进细胞质信号传导。 GPCR-G蛋白复合物的结构测定对于了解信号转导的精确机制至关重要。然而，由于它们的构象动态和固有的短暂性质，这些复合物是结构研究的具有挑战性的目标。我们最近开发了一种工程化的G蛋白，微型G ，解决了这些问题，并允许形成稳定的GPCR-G蛋白复合物。 Mini-G 促进了人腺苷A 2A受体（A 2A 2A）在其G蛋白结合构象中的结构测定，在3.4 Å分辨率。在这里，我们描述了A 2A R R的表达和纯化的一步一步的方案，并且A 2AA-R-mini-G'子>复杂。
背景 我们最近开发了一种工程化的最小G蛋白，迷你G（Carpenter和Tate，2016），其促进了人腺苷A 2A受体的结构测定（A <其活性状态（carpenter等人，2016）。 mini-g="">充分稳定A 2A R的活性构象，以允许络合物在洗涤剂辛硫基葡糖苷中通过蒸气扩散结晶。在这里，我们描述了一种用于表达和纯化Aβ2A ...
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| Production, Purification and Crystallization of a Prokaryotic SLC26 Homolog for Structural Studies
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Author:
Date:
2017-02-05
[Abstract] The SLC26 or SulP proteins constitute a large family of anion transporters that are ubiquitously expressed in pro- and eukaryotes. In human, SLC26 proteins perform important roles in ion homeostasis and malfunctioning of selected members is associated with diseases. This protocol details the production and crystallization of a prokaryotic SLC26 homolog, termed SLC26Dg, from Deinococcus geothermalis. Following these instructions we obtained well-folded and homogenous material of the membrane protein SLC26Dg and the nanobody Nb5776 that enabled us to crystallize the complex and determine its structure (Geertsma et al., 2015). The procedure may be adapted to purify and crystallize other membrane protein complexes.
[摘要] SLC26或SulP蛋白构成在亲和真核生物中普遍表达的大量阴离子转运蛋白。在人类中，SLC26蛋白在离子稳态中起重要作用，选择成员的功能障碍与疾病有关。该方案详细描述了来自地热异常球菌的原核SLC26同源物（称为SLC26Dg）的产生和结晶。按照这些说明，我们获得了膜蛋白SLC26Dg和纳米体Nb5776的良好折叠和均匀的材料，使我们能够使复合物结晶并确定其结构（Geertsma等人，2015）。该方法可以适于纯化和结晶其它膜蛋白复合物。
背景 除了少数例外，膜蛋白的结构表征涉及蛋白质生产水平，洗涤剂溶解状态下的稳定化和结晶的挑战。克服这些障碍所采取的策略取决于有效选择具有优异生物化学性质的SLC26同系物和使用抗体作为结晶伴侣（Geertsma等人，2015）。这里描述的程序并没有大大偏离同事的程序，但在几点上，我们采用其他方法。例如，对于蛋白质生产，我们利用araBAD启动子（Guzman等人，1995），而不是流行的T7启动子（Studier等人，1990）。与T7启动子相反，PAD启动子允许直接调节蛋白质生产水平及其对下游折叠机械的能力的调节，从而减少包涵体的形成（Geertsma， et ...
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