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Author:
Date:
2018-09-20
[Abstract] Polyphosphate (polyP), a universally conserved biomolecule, is composed of up to 1,000 phosphate monomers linked via phosphoanhydride bonds. Reaching levels in bacteria that are in the high nmoles per mg protein range, polyP plays important roles in biofilm formation and colonization, general stress protection and virulence. Various protocols for the detection of polyP in bacteria have been reported. These methods primarily differ in the ways that polyP is extracted and/or detected. Here, we report an improved method, in which we combine polyP extraction via binding to glassmilk with a very sensitive PolyP kinase/luciferase-based detection system. By using this procedure, we significantly enhanced the sensitivity of polyP detection, making it potentially applicable for mammalian tissues.
[摘要] 多磷酸盐（polyP）是一种普遍保守的生物分子，由多达1,000个通过磷酸酐键连接的磷酸盐单体组成。 达到每毫克蛋白质高纳摩尔细菌的水平，polyP在生物膜形成和定植，一般应力保护和毒力中起重要作用。 已经报道了用于检测细菌中polyP的各种方案。 这些方法主要在于提取和/或检测polyP的方式不同。 在这里，我们报告了一种改进的方法，其中我们结合polyP提取通过结合到玻璃奶与非常敏感的PolyP激酶/荧光素酶检测系统。 通过使用该程序，我们显着增强了polyP检测的灵敏度，使其可能适用于哺乳动物组织。
【背景】聚磷酸盐（polyP）是一种由多达1,000种无机磷酸盐单体的直链组成的生物聚合物，存在于生命的所有三个领域的细胞中。然而，细菌是唯一已经充分研究了polyP代谢酶的生物。将ATP转化为polyP的细菌polyP激酶（PPK）催化正向和反向反应。虽然polyP的合成显然是细胞中有利的反应，但通过在体外提供足够量的ADP ，该酶可用于从polyP产生ATP，使得基于荧光素酶的ATP检测成为可能（Ault -Riché et al。，1998）。缺乏PPK的细菌在生物膜形成，运动性，持久性和各种应激反应方面存在缺陷，并显示出对次卤酸（即，漂白）应激或磷酸盐饥饿的显着增加的敏感性（图1）（Rao et al。，2009; Gray et ...
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Date:
2017-02-05
[Abstract] The anaerobic, gastrointestinal pathogen, Clostridium difficile, persists within the environment and spreads from host-to-host via its infectious form, the spore. To effectively study spore formation, the physical differentiation of vegetative cells from spores is required to determine the proportion of spores within a population of C. difficile. This protocol describes a method to accurately enumerate both viable vegetative cells and spores separately and subsequently calculate a sporulation frequency of a mixed C. difficile population from various in vitro growth conditions (Edwards et al., 2016b).
[摘要] 厌氧，胃肠道病原体，艰难梭菌在环境中持续存在，并通过其感染形式，孢子从宿主到宿主传播。为了有效地研究孢子形成，需要从孢子中进行营养细胞的物理分化以确定在C群体内孢子的比例。艰难的。该方案描述了分别精确地枚举活的营养细胞和孢子的方法，并随后计算混合的孢子形成频率。来自各种体外生长条件（Edwards等人，2016b）的难治性群体。
背景 孢子形成是一个复杂的发育过程，导致代谢休眠孢子的形成。 C的物理性质。艰难的孢子形式提供了许多环境胁迫和消毒剂的内在抵抗，允许其在宿主之外的长期生存（参见：Paredes-Sabja等人，2014年）。区分营养细胞和C孢子。已经开发了利用孢子的物理和抗性属性的各种技术，包括短时间暴露于湿热或乙醇（Burns等人，2010; Lawley＆amp; et al。，2010; Edwards等人，2014）。然而，根据C的应变，这些技术可能不经意地对孢子造成长期损害。难以测试，导致恢复率不准确。在这里，我们描述了使用比以前描述的较低浓度的乙醇（40％以下的乙醇）的优化方法以消除异质C中的所有营养细胞。艰难梭菌群体，而不降低孢子的生存力。该技术为量化C提供了高度可重现性和较不可变的结果。难产孢子孢子形成。
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