| In vitro RNA-dependent RNA Polymerase Assay Using Arabidopsis RDR6
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] RNA-dependent RNA polymerases (RdRPs) in eukaryotes convert single-stranded RNAs into double-stranded RNAs, thereby amplifying small interfering RNAs that play crucial roles in the regulation of development, maintenance of genome integrity and antiviral immunity. Here, we describe a method of in vitro RdRP assay using recombinant Arabidopsis RDR6 prepared by an insect expression system. By using this classical biochemical assay, we revealed that RDR6 has a strong template preference for RNAs lacking a poly(A) tail. This simple method will be applicable to other RdRPs in Arabidopsis and different organisms.
[摘要] 真核生物中的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）将单链RNA转化为双链RNA，从而扩增在调节发育，维持基因组完整性和抗病毒免疫方面起关键作用的小干扰RNA。 在此，我们描述了使用通过昆虫表达系统制备的重组拟南芥RDR6的体外RdRP测定的方法。 通过使用这种经典的生物化学分析，我们发现RDR6有一个强大的模板偏好RNAs缺乏poly（A）尾巴。 这个简单的方法将适用于拟南芥属和其他生物体中的其他RdRPs。
【背景】已经在所有真核生物王国 - 植物，真菌，原生动物和动物中发现RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）基因（Zong等人，2009）。它们将单链RNA（ssRNA）转化为双链RNA（dsRNA），从而扩增在各种生物过程中发挥关键作用的小干扰RNA（siRNA），包括调节发育（Peragine等人， ，2004; Li等人，2005），维持基因组完整性（Volpe等人，2002; Xie等人，2004年， ）和抗病毒免疫性（Mourrain等人，2000; Yu等人，2003; Garcia-Ruiz等人，2010; Wang ，2010）。除了这种RdRP活性之外，RdRP还具有称为末端核苷酸转移酶（TNTase）活性的另一种酶活性（Curaba和Chen，2008; ...
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| Validating Candidate Congenital Heart Disease Genes in Drosophila
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] Genomic sequencing efforts can implicate large numbers of genes and de novo mutations as potential disease risk factors. A high throughput in vivo model system to validate candidate gene association with pathology is therefore useful. We present such a system employing Drosophila to validate candidate congenital heart disease (CHD) genes. The protocols exploit comprehensive libraries of UAS-GeneX-RNAi fly strains that when crossed into a 4XHand-Gal4 genetic background afford highly efficient cardiac-specific knockdown of endogenous fly orthologs of human genes. A panel of quantitative assays evaluates phenotypic severity across multiple cardiac parameters. These include developmental lethality, larva and adult heart morphology, and adult longevity. These ...
[摘要] 基因组测序工作可能涉及大量基因和从头突变作为潜在的疾病风险因素。 因此，用于验证候选基因与病理学关联的高通量体内模型系统是有用的。 我们提出了使用果蝇来验证候选先天性心脏病（CHD）基因的这种系统。 这些方案利用了UAS-GeneX-RNAi飞行菌株的综合文库，当跨越4XHand-Gal4遗传背景时，提供了人类基因内源性直向同源物的高效心脏特异性敲低。 一组定量测定评估多种心脏参数的表型严重程度。 这些包括发育致死率，幼虫和成人心脏形态以及成年人的长寿。 这些方案最近被用于评估患者全外显子测序所涉及的100多个候选CHD基因（Zhu等，2017）。
【背景】（Bier和Bodmer，2004; Cagan，2011; Zhang et al。，2013; Owusu-Ansah和Perrimon，2014; Diop和Bodmer，2015; Na et al。等等，2015），75％的人类疾病相关基因由飞行基因组中的功能同系物表示（Reiter et al。，2001）。尽管将果蝇发育表型直接与患者症状联系起来是一个挑战，果蝇可以作为一个非常复杂和有效的平台来测试和验证候选疾病基因功能在开发中，这可以很容易地扩大到评估大量的候选基因从患者基因组测序工作中确定。基于进化保守的心脏发育遗传机制，果蝇已被用于研究与冠心病相关20多年的基因（Bier和Bodmer，2004; ...
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| Synthetic Lethality Screens Using RNAi in Combination with CRISPR-based Knockout in Drosophila Cells
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Author:
Date:
2017-02-05
[Abstract] A synthetic lethal interaction is a type of genetic interaction where the disruption of either of two genes individually has little effect but their combined disruption is lethal. Knowledge of synthetic lethal interactions can allow for elucidation of network structure and identification of candidate drug targets for human diseases such as cancer. In Drosophila, combinatorial gene disruption has been achieved previously by combining multiple RNAi reagents. Here we describe a protocol for high-throughput combinatorial gene disruption by combining CRISPR and RNAi. This approach previously resulted in the identification of highly reproducible and conserved synthetic lethal interactions (Housden et al., 2015).
[摘要] 合成的致死相互作用是一种遗传相互作用，其中两种基因之一的破坏单独具有影响，但它们的组合破坏是致命的。有关合成致死相互作用的知识可以帮助阐明网络结构和确定人类疾病如癌症的候选药物靶标。在果蝇中，组合基因破坏已经通过组合多个RNAi试剂而实现。这里我们通过组合CRISPR和RNAi来描述高通量组合基因破坏的协议。这种方法以前导致了高度可重现和保守的合成致死相互作用的识别（Housden等人，2015）。
背景 遗传相互作用的知识，如合成致死性，对于确定基因之间的功能关系可能是无价的。例如，酵母中的大规模遗传相互作用屏幕最近被用于组装全球“细胞功能的接线图”（Costanzo等人，2016）。或者，可以使用特定类型的遗传相互作用，例如合成致死相互作用来鉴定包括癌症在内的疾病的药物靶标（Kaelin，2005）。
＆nbsp;鉴定合成相互作用需要组合破坏两个基因。以前在果蝇细胞培养中实现该方法的方法是同时递送多个dsRNA试剂（例如，Fisher等人，2015）。然而，RNAi试剂具有局限性，包括脱靶效应和不完全靶标敲低，当多个试剂一起递送时，RNAi试剂复合。通过将CRISPR诱变与单个dsRNA处理相结合，可以避免这些问题，从而更简单地解释筛选结果并强化“点击”识别。
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