| Affinity Purification of GO-Matryoshka Biosensors from E. coli for Quantitative Ratiometric Fluorescence Analyses
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Author:
Date:
2020-10-05
[Abstract] Genetically encoded biosensors are powerful tools for quantitative visualization of ions and metabolites in vivo. Design and optimization of such biosensors typically require analyses of large numbers of variants. Sensor properties determined in vitro such as substrate specificity, affinity, response range, dynamic range, and signal-to-noise ratio are important for evaluating in vivo data. This protocol provides a robust methodology for in vitro binding assays of newly designed sensors. Here we present a detailed protocol for purification and in vitro characterization of genetically encoded sensors, exemplified for the His affinity-tagged GO-(Green-Orange) MatryoshCaMP6s calcium sensor. GO-Matryoshka sensors are based on single-step insertion ...
[摘要] [摘要]遗传编码的生物传感器是强大的工具为离子和代谢物的定量可视化在体内。设计和优化此类生物传感器通常需要分析大量变体。体外确定的传感器特性，例如底物特异性，亲和力，响应范围，动态范围和信噪比，对于评估体内数据很重要。该协议为新设计的传感器的体外结合测定提供了可靠的方法。这里我们提出了一个详细的协议用于纯化和体外表征的遗传编码的传感器，例示的His亲和标记的GO-（绿橙色）MatryoshCaMP6s钙传感器。GO-Matryoshka传感器基于在感兴趣的结合蛋白内一步插入一个包含两个嵌套荧光蛋白，圆形排列的荧光绿色FP（cpGFP ）和Large Stoke Shift LSSmOrange的盒的方法，从而产生了利用被分析物触发的比例式传感器cpGFP的荧光变化。
[背景技术]将绿色荧光蛋白（GFP）在1962年被鉴定在水母水母维多利亚（下村等人，1962） 。30年后，描述了其首次用作报道基因（Chalfie等，1994）。自从发现以来，GFP变体和其他荧光蛋白为生物科学的主要进步做出了巨大贡献，并且现在已成为生物医学研究中的常用工具（Frommer等，2009）。
各种荧光蛋白（FP）和FP变异体已被用作报道分子或与所有生命王国的生物体中的蛋白融合（Chudakov等，2010 ；Valeur和Berberan- ...
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| Production, Purification and Crystallization of a Prokaryotic SLC26 Homolog for Structural Studies
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Author:
Date:
2017-02-05
[Abstract] The SLC26 or SulP proteins constitute a large family of anion transporters that are ubiquitously expressed in pro- and eukaryotes. In human, SLC26 proteins perform important roles in ion homeostasis and malfunctioning of selected members is associated with diseases. This protocol details the production and crystallization of a prokaryotic SLC26 homolog, termed SLC26Dg, from Deinococcus geothermalis. Following these instructions we obtained well-folded and homogenous material of the membrane protein SLC26Dg and the nanobody Nb5776 that enabled us to crystallize the complex and determine its structure (Geertsma et al., 2015). The procedure may be adapted to purify and crystallize other membrane protein complexes.
[摘要] SLC26或SulP蛋白构成在亲和真核生物中普遍表达的大量阴离子转运蛋白。在人类中，SLC26蛋白在离子稳态中起重要作用，选择成员的功能障碍与疾病有关。该方案详细描述了来自地热异常球菌的原核SLC26同源物（称为SLC26Dg）的产生和结晶。按照这些说明，我们获得了膜蛋白SLC26Dg和纳米体Nb5776的良好折叠和均匀的材料，使我们能够使复合物结晶并确定其结构（Geertsma等人，2015）。该方法可以适于纯化和结晶其它膜蛋白复合物。
背景 除了少数例外，膜蛋白的结构表征涉及蛋白质生产水平，洗涤剂溶解状态下的稳定化和结晶的挑战。克服这些障碍所采取的策略取决于有效选择具有优异生物化学性质的SLC26同系物和使用抗体作为结晶伴侣（Geertsma等人，2015）。这里描述的程序并没有大大偏离同事的程序，但在几点上，我们采用其他方法。例如，对于蛋白质生产，我们利用araBAD启动子（Guzman等人，1995），而不是流行的T7启动子（Studier等人，1990）。与T7启动子相反，PAD启动子允许直接调节蛋白质生产水平及其对下游折叠机械的能力的调节，从而减少包涵体的形成（Geertsma， et ...
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