| HIVGKO: A Tool to Assess HIV-1 Latency Reversal Agents in Human Primary CD4+ T Cells
|
|
Author:
Date:
2018-10-20
[Abstract] While able to suppress HIV replication in HIV infected individuals, combination antiretroviral therapy (ART) fails to eliminate viral latent reservoir, which consists in integrated transcriptional silenced HIV provirus. So far, identification of latently-infected cells has relied on activating cells to induce expression of HIV proteins which can then be detected. Unfortunately, this activation significantly changed the cell phenotype. We developed a novel HIV reporter, named HIVGKO, that allows the purification of latently-infected cells in absence of reactivation. Indeed, latent cells can be identified by expression of the EF1a-driven mKO2 and lack of expression of the LTR-driven csGFP. This protocol can be used to study the effectiveness of LRAs (Latency Reversal Agents) in ...
[摘要] 虽然能够抑制HIV感染个体中的HIV复制，但联合抗逆转录病毒疗法（ART）无法消除病毒潜伏性储库，其包含整合的转录沉默的HIV原病毒。 到目前为止，潜伏感染细胞的鉴定依赖于激活细胞以诱导HIV蛋白的表达，然后可以检测到这些蛋白的表达。 不幸的是，这种激活显着改变了细胞表型。 我们开发了一种名为HIV GKO 的新型HIV报告基因，可以在没有再激活的情况下纯化潜伏感染的细胞。 实际上，可以通过EF1a驱动的mKO2的表达和LTR驱动的csGFP的缺乏表达来鉴定潜伏细胞。 该方案可用于研究LCA（潜伏期逆转剂）在原代细胞中重新激活潜伏HIV的有效性。
【背景】新版双标记病毒（HIV GKO ）含有5'LTR中HIV-1启动子控制下的密码子转换eGFP（csGFP）和一种独特的无关荧光蛋白 mKO2在细胞延伸因子αα启动子（EF1α）的控制下。 当使用与遗传相关的荧光蛋白时，由于重组问题，在这些报道分子中使用不相关的荧光蛋白是很重要的。 因此，生产性感染的细胞主要是csGFP + mKO2 + （有些可能只是GFP + ），而潜伏感染的细胞是csGFP - mKO2 + 。 流式细胞仪如分拣机AriaII允许纯化纯感染人群（生产性，潜伏性和/或未感染），而分析仪LSRII允许评估HIV GKO LTR的转录激活。 感染后的时间很短。
|
|
|
| Immunohistochemical Identification of Human Skeletal Muscle Macrophages
|
|
Author:
Kate Kosmac, Bailey D. Peck, R. Grace Walton, Jyothi Mula, Philip A. Kern, Marcas M. Bamman, Richard A. Dennis, Cale A. Jacobs, Christian Lattermann, Darren L. Johnson and Charlotte A. Peterson,
Date:
2018-06-20
[Abstract] Macrophages have well-characterized roles in skeletal muscle repair and regeneration. Relatively little is known regarding the role of resident macrophages in skeletal muscle homeostasis, extracellular matrix remodeling, growth, metabolism and adaptation to various stimuli including exercise and training. Despite speculation into macrophage contributions during these processes, studies characterizing macrophages in non-injured muscle are limited and methods used to identify macrophages vary. A standardized method for the identification of human resident skeletal muscle macrophages will aide in the characterization of these immune cells and allow for the comparison of results across studies. Here, we present an immunohistochemistry (IHC) protocol, validated by flow cytometry, to distinctly ...
[摘要] 巨噬细胞在骨骼肌修复和再生中具有很好的特征。关于驻留巨噬细胞在骨骼肌动态平衡，细胞外基质重塑，生长，代谢和适应各种刺激（包括运动和训练）中的作用知之甚少。尽管在这些过程中推测了巨噬细胞的贡献，但表征非受伤肌肉中的巨噬细胞的研究是有限的，用于鉴定巨噬细胞的方法各不相同。用于鉴定人类骨骼肌巨噬细胞的标准化方法将有助于鉴定这些免疫细胞，并可用于各研究结果的比较。在这里，我们提出免疫组织化学（IHC）协议，通过流式细胞术验证，以清楚地识别常驻人类骨骼肌巨噬细胞种群。我们显示CD11b和CD206双IHC有效识别人骨骼肌中的巨噬细胞。此外，非受伤人骨骼肌中的大多数巨噬细胞表现出“混合”M1 / M2表型，表达CD11b，CD14，CD68，CD86和CD206。在休息的骨骼肌中存在相对较少的CD11b + / CD206-巨噬细胞群。这种人口的相对丰度的变化可能反映了骨骼肌肉环境的重要变化。肌肉中的CD11b和CD206 IHC也显示出巨噬细胞的不同形态学特征，这些特征可能与这些细胞的功能状态有关。
【背景】巨噬细胞是能够适应局部微环境变化的多向性免疫细胞。在过去几年中，研究表明巨噬细胞表型是动态的，存在于连续统一体中（Mosser and Edwards，2008，Italiani and Boraschi，2014，Martinez and ...
|
|
|
| Dual-probe RNA FRET-FISH in Yeast
|
|
Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] mRNA Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) is a technique commonly used to profile the distribution of transcripts in cells. When combined with the common single molecule technique Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), FISH can also be used to profile the co-expression of nearby sequences in the transcript to measure processes such as alternate initiation or splicing variation of the transcript. Unlike in a conventional FISH method using multiple probes to target a single transcript, FRET is limited to the use of two probes labeled with matched dyes and requires the use of sensitized emission. Any widefield microscope capable of sensitive single molecule detection of Cy3 and Cy5 should be able to measure FRET in yeast cells. Alternatively, a FRET-FISH method can be ...
[摘要] mRNA荧光原位杂交（FISH）是一种常用于分析细胞中转录物分布的技术。 当与常见的单分子技术荧光共振能量转移（FRET）相结合时，FISH也可用于分析转录本中附近序列的共表达以测量转录本的替代启动或剪接变异等过程。 与使用多个探针靶向单个转录物的常规FISH方法不同，FRET限于使用用匹配染料标记的两个探针，并且需要使用敏化发射。 任何能够灵敏地检测Cy3和Cy5单分子的宽视场显微镜应该能够测量酵母细胞中的FRET。 或者，可以使用FRET-FISH方法明确确定转录本的身份，而不使用其他FISH技术中使用的引导探针组。
【背景】单细胞转录物分布的定量通常通过用多个探针靶向mRNA来实现，以实现可以与非特异性结合的探针区分开的明亮信号（Raj和Tyagi，2010）。但是，在某些情况下，转录本上有特征，例如剪接变体或替代起始位点，这与常规FISH探针组无法区分。这些同种型序列可以具有短的50nt唯一识别序列。使用两种探针，可以使用FRET对定位结合的任一侧，同时定量多达三种mRNA同种型，例如，具有两种探针的同种型（FRET），具有探针1的同种型仅限于探针2的同种型。依赖于单个荧光团或荧光团对需要通过EMCCD进行灵敏检测。而且，可以使用FRET对（Wadsworth等人，2017）来估计没有其他同种型的序列的探针的检测效率。
|
|
|