| Gene Expression and Genome Editing Systems by Direct Delivery of Macromolecules Into Rice Egg Cells and Zygotes
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Author:
Date:
2020-07-20
[Abstract] Polyethylene glycol calcium (PEG-Ca2+)-mediated transfection allows rapid and efficient examination to analyze diverse cellular functions of genes of interest. In plant cells, macromolecules, such as DNA, RNA and protein, are delivered into protoplasts derived from somatic tissues or calli via PEG-Ca2+ transfection. To broaden and develop the scope of investigations using plant gametes and zygotes, a procedure for direct delivery of macromolecules into these cells has recently been established using PEG-Ca2+ transfection. This PEG-Ca2+-mediated delivery into rice egg cells/zygotes consists of four microtechniques, (i) isolation of gametes, (ii) production of zygotes by electrofusion of gametes, (iii) PEG-Ca2+-mediated delivery of ...
[摘要] [摘要 ] P olyethylene乙二醇钙（PEG-的Ca 2+ ）介导的转染允许快速和有效的检查来分析感兴趣的基因的不同的细胞功能。在植物细胞中，大分子，例如DNA，RNA和蛋白质，通过PEG-Ca 2+ 转染被传递到源自体组织或愈伤组织的原生质体中。牛逼Ø拓宽和开发利用植物的配子和合子，直接递送大分子进入这些细胞最近已经采用PEG-钙建立过程调查范围2+ 转染。这种PEG-Ca 2+ 介导的传递至水稻卵细胞/受精卵的过程包括四个 微技术，（i ）配子的分离，（ii）通过配子的电融合产生合子，（iii）PEG-Ca 2+ 介导的大分子向分离的卵细胞或产生的合子的传递，以及（iv）的培养和随后的分析转染的卵细胞/受精卵。因为对于完整的协议microtechniques （我）和（ii）已在户报告等人。，2016年，microtechniques （iii）和（iv）的主要是在第描述是协议。
[背景 ] 在被子植物中，受精和随后的发育事件，诸如胚胎发生和胚乳发育，发生在深深嵌入卵形组织胚囊（Nawaschin ，1898; Guignard ，1899;罗素，1992;拉加，2003） ...
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| A Protocol for Production of Mutant Mice Using Chemically Synthesized crRNA/tracrRNA with Cas9 Nickase and FokI-dCas9
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Date:
2017-06-05
[Abstract] The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) system is the most widely used genome editing tool. A common CRISPR/Cas9 system consists of two components: a single-guide RNA (sgRNA) and Cas9. Both components are required for the introduction of a double-strand break (DSB) at a specific target sequence. One drawback of this system is that the production of sgRNA in the laboratory is laborious since it requires cloning of an sgRNA sequence, in vitro transcription reaction and sgRNA purification. An alternative to targeting Cas9 activity by sgRNA is to target it with two small RNAs: CRISPR RNA (crRNA) and trans-activating crRNA (tracrRNA). Both of these small RNAs can be chemically synthesized which makes the production of ...
[摘要] 聚类规则间隔短回文重复（CRISPR）/ CRISPR相关蛋白9（Cas9）系统是使用最广泛的基因组编辑工具。一个常见的CRISPR / Cas9系统由两个组成部分组成：单导RNA（sgRNA）和Cas9。在特定靶序列引入双链断裂（DSB）需要两种成分。该系统的一个缺点是实验室中sgRNA的生产是费力的，因为它需要在体外转录反应和sgRNA纯化之间克隆sgRNA序列。通过sgRNA靶向Cas9活性的替代方案是用两种小RNA：CRISPR RNA（crRNA）和反式激活性crRNA（tracrRNA）进行靶向。这两种小RNA可以化学合成，这使得与sgRNA相比，这些RNA的产生不那么困难。 CRISPR / Cas9系统的另一个缺点是已经报告了脱靶效应。然而，已经开发了改进形式的Cas9以最小化离靶效应。例如，仅当两个引导RNA在规定的距离内结合相对的链时，切口酶型Cas9（nCas9）和FokI结构域融合的催化无活性的Cas9（FokI-dCas9; fCas9）才诱导DSB。在本协议中，我们描述了使用结合crRNA，tracrRNA和Cas9修饰形式的CRISPR / Cas9系统来生产突变小鼠的实验系统。该方法不仅有利于制备用于基因组编辑系统的试剂，而且可以降低脱靶效应的风险。
背景 ...
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| Electro-fusion of Gametes and Subsequent Culture of Zygotes in Rice
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Author:
Date:
2016-12-20
[Abstract] Electro-fusion system with isolated gametes has been utilized to dissect fertilization-induced events in angiosperms, such as egg activation, zygote development and early embryogenesis, since the female gametophytes of plants are deeply embedded within ovaries. In this protocol, procedures for isolation of rice gametes, electro-fusion of gametes, and culture of the produced zygotes are described.
[摘要] 已经利用具有孤立配子的电融合系统来解剖被子植物中受精诱导的事件，例如卵活化，合子发育和早期胚胎发生，因为植物的雌配子体深深嵌入卵巢内。在该方案中，描述了分离水稻配子，配子电融合和产生的受精卵培养的程序。
背景 被子植物的受精和后续事件，如胚胎发生和胚乳发育，发生在深入嵌入卵母细胞的胚囊中（Nawaschin，1898; Guignard，1899; Russell，1992; Raghavan，2003）。因此，分离的配子已被用于体外受精（IVF）系统，以观察和分析受精和后处理过程（Wang等人，2006年）。用于被子植物的IVF系统包括三种基本微技术的组合：（i）男性和女性配子的分离和选择; （ii）配对对和（iii）单细胞培养物的融合（Kranz，1999）。已经在广泛的植物物种中建立了分离活的配子的程序，包括单子叶植物和双子叶植物（综述于Kranz，1999和Okamoto，2011）。分离的配子可以电融合（Kranz等人，1991; Uchiumi等人，2006和2007）或化学地使用钙（Faure等人，1994; Kranz和Lörz，1994; Khalequzzaman和Haq，2005），聚乙二醇（Sun等，1995; ...
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