| Dual Fluorescence Reporter Based Analytical Flow Cytometry for miRNA Induced Regulation in Mammalian Cells
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Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] MicroRNA-induced gene regulation is a growing field in basic and translational research. Examining this regulation directly in cells is necessary to validate high-throughput data originated from RNA sequencing technologies. For this several studies employ luciferase-based reporters that usually measure the whole cell population, which comes with low resolution for the complexity of the miRNA-induced regulation. Here, we provide a protocol using a dual-fluorescence reporter and flow cytometry reaching single cell resolution; the protocol contains a simplified workflow that includes: vector generation, data acquisition, processing, and analysis using the R environment. Our protocol enables high-resolution measurements of miRNA induced post-transcriptional gene regulation and combined with ...
[摘要] MicroRNA诱导的基因调控是基础和转化研究中不断增长的领域。 直接在细胞中检查该调节对于验证源自RNA测序技术的高通量数据是必要的。 对于这一研究，一些研究采用基于荧光素酶的报告基因，通常测量全细胞群，其具有低分辨率的miRNA诱导调节的复杂性。 在这里，我们提供使用双荧光报告基因和流式细胞仪达到单细胞分辨率的方案; 该协议包含一个简化的工作流程，包括：使用R环境进行矢量生成，数据采集，处理和分析。 我们的协议可实现miRNA诱导的转录后基因调控的高分辨率测量，并结合系统生物学，可用于估计miRNA的熟练程度。
【背景】MicroRNAs（miRNA）是高度保守的小型非蛋白质编码RNA（21-22nt），可调节转录后基因表达并调节基因生物学过程，如发育和细胞稳态（Lagos-Quintana et al。，2001; Fabian et al。，2010; Bartel，2018），包括miRNA表达与肿瘤进展和侵袭性相关的几种病理（Lu et al。， 2005; Di Leva和Croce，2013; Krishnan et al。，2015; Bertoli et ...
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| Screening for Novel Endogenous Inflammatory Stimuli Using the Secreted Embryonic Alkaline Phosphatase NF-κB Reporter Assay
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] An immune response can be activated by pathogenic stimuli, as well as endogenous danger signals, triggering the activation of pattern recognition receptors and initiating signalling cascades that lead to inflammation. This method uses THP1-BlueTM cells, a human monocytic cell line which contains an embryonic alkaline phosphatase reporter gene allowing the detection of NF-κB-induced transcriptional activation. We validated this protocol by assessing NF-κB activation after stimulation of toll-like receptor 4 (TLR4) by two different agonists: lipopolysaccharide (LPS), derived from the cell wall of Gram negative bacteria, and tenascin-C, an extracellular matrix protein whose expression is induced upon tissue injury. We then used this protocol to screen for potential new endogenous ...
[摘要] 免疫反应可以被致病性刺激以及内源性危险信号激活，引发模式识别受体的激活并引发导致炎症的信号级联。该方法使用THP1-Blue TM 细胞，其是含有能够检测NF-κB诱导的转录激活的胚胎碱性磷酸酶报告基因的人单核细胞系。通过两种不同的激动剂刺激toll样受体4（TLR4）后，通过评估NF-κB活化来验证该方案：从革兰氏阴性细菌的细胞壁衍生的脂多糖（LPS）和腱生蛋白C，细胞外基质蛋白其组织损伤引起其表达。然后我们使用该方案筛选潜在的新的内源性TLR4激动剂，但是该方法也可以用作快速，经济和可靠的方法来测定导致TLR依赖性NF-κB活化的其它炎性刺激的活性。
免疫系统已经发展成不仅识别病原性刺激物，例如细菌成分和病毒核酸，还包括内源性危险信号，包括从坏死细胞分泌的蛋白质或表达于组织损伤。通过模式识别受体感测到两种类型的刺激，启动触发炎症反应的信号级联。活化的B细胞（NF-κB）的核因子κ-轻链增强子是激活对感染和组织损伤的免疫应答所必需的转录因子。 NF-κB在模式识别受体激活后，在广泛的炎症介质的表达中具有重要作用，包括细胞因子（如肿瘤坏死因子α[TNFα]，白细胞介素-6和白细胞介素-1），趋化因子例如白细胞介素-8或CXCL1），蛋白酶，生长因子和MHC相关分子等。为了评估在TLR4下游的该途径的活化，我们使用市售的细胞系THP1-Blue ...
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| Generation of Tumour-stroma Minispheroids for Drug Efficacy Testing
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Author:
Date:
2017-01-05
[Abstract] The three-dimensional organisation of cells in a tissue and their interaction with adjacent cells and extracellular matrix is a key determinant of cellular responses, including how tumour cells respond to stress conditions or therapeutic drugs (Elliott and Yuan, 2011). In vivo, tumour cells are embedded in a stroma formed primarily by fibroblasts that produce an extracellular matrix and enwoven with blood vessels. The 3D mixed cell type spheroid model described here incorporates these key features of the tissue microenvironment that in vivo tumours exist in; namely the three-dimensional organisation, the most abundant stromal cell types (fibroblasts and endothelial cells), and extracellular matrix. This method combined with confocal microscopy can be a powerful tool to ...
[摘要] 组织中细胞的三维组织及其与相邻细胞和细胞外基质的相互作用是细胞反应的关键决定因素，包括肿瘤细胞如何对应激条件或治疗药物的反应（Elliott和Yuan，2011）。在体内，肿瘤细胞被包埋在主要由成纤维细胞形成的基质中，所述成纤维细胞产生细胞外基质并用血管编织。这里描述的3D混合细胞类型球体模型包括了体内存在肿瘤的组织微环境的这些关键特征;即三维组织，最丰富的基质细胞类型（成纤维细胞和内皮细胞）和细胞外基质。该方法结合共聚焦显微镜可以成为不同肿瘤类型的药物敏感性，血管生成和细胞迁移/侵袭测定的有力工具。
背景 传统的单层细胞培养（二维）强化人造环境，其与体内存在的组织细胞大不相同。最重要的区别之一是在单层培养物中，细胞是极化的，即，面向培养物的细胞表面和暴露于培养基的上细胞表面完全不同，经常反对的信号（Fitzgerald等人，2015）。为了解决细胞极化的问题，肿瘤球状体培养越来越多地用于癌症研究。肿瘤球体可以通过减少其通常发生在单层培养物中的生长培养基的扩散和稀释，通过细胞因子和趋化因子复制存在于组织中的三维细胞 - 细胞相互作用和一定程度的旁分泌信号传导（Lawlor等，2002; ...
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