| A Small RNA Isolation and Sequencing Protocol and Its Application to Assay CRISPR RNA Biogenesis in Bacteria
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Author:
Date:
2018-02-20
[Abstract] Next generation high-throughput sequencing has enabled sensitive and unambiguous analysis of RNA populations in cells. Here, we describe a method for isolation and strand-specific sequencing of small RNA pools from bacteria that can be multiplexed to accommodate multiple biological samples in a single experiment. Small RNAs are isolated by polyacrylamide gel electrophoresis and treated with T4 polynucleotide kinase. This allows for 3’ adapter ligation to CRISPR RNAs, which don’t have pre-existing 3’-OH ends. Pre-adenylated adapters are then ligated using T4 RNA ligase 1 in the absence of ATP and with a high concentration of polyethylene glycol (PEG). The 3’ capture step enables precise determination of the 3’ ends of diverse RNA molecules. Additionally, a random hexamer in the ligated ...
[摘要] 新一代高通量测序技术能够对细胞中的RNA群体进行敏感和明确的分析。在这里，我们描述了一种从细菌中分离和链特异性测序小RNA池的方法，所述细菌可以在单个实验中多路复用以容纳多个生物样品。小RNA通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并用T4多核苷酸激酶处理。这允许3'衔接头连接至CRISPR RNA，其不具有预先存在的3'-OH末端。然后使用T4 RNA连接酶1在不存在ATP和高浓度聚乙二醇（PEG）的情况下将前腺苷酸化的衔接子连接。 3'捕获步骤能够精确测定不同RNA分子的3'末端。此外，连接适配器中的随机六聚体有助于控制潜在的下游扩增偏差。逆转录后，将cDNA产物环化并通过PCR制备文库。我们显示扩增的文库不需要通过凝胶电泳可见，以期望产物的有效测序。使用这种方法，我们通常从少量纯化的小RNA制备RNA测序文库。该协议适合于通过对成熟的CRISPR RNA进行测序来测定细菌中的CRISPR RNA生物合成，但可以用于测序不同类型的小RNA。我们还提供了一个完整的数据处理管道示例，并提供了运行所提供脚本的说明。
【背景】与聚集的经常散布的短回文重复序列（CRISPR）相关的遗传模块赋予不同的原核宿主适应性免疫（Barrangou et ...
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| Affinity Pulldown of Biotinylated RNA for Detection of Protein-RNA Complexes
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Author:
Date:
2016-12-20
[Abstract] RNA-binding proteins (RBPs) have recently emerged as crucial players in the regulation of gene expression. The interactions of RBPs with target mRNAs control the levels of gene products by altering different regulatory steps, including pre-mRNA splicing and maturation, nuclear mRNA export, and mRNA stability and translation (Glisovic et al., 2008). There are several methodologies available today to identify RNAs bound to specific RBPs; some detect only recombinant molecules in vitro, others detect recombinant and endogenous molecules, while others detect only endogenous molecules. Examples include systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX), biotinylated RNA pulldown assay, RNA immunoprecipitation (RIP) assay, electrophoretic mobility shift assay ...
[摘要] RNA结合蛋白（RBP）近来已经成为调控基因表达的关键因素。 RBP与靶mRNA的相互作用通过改变不同的调节步骤来控制基因产物的水平，包括mRNA前体剪接和成熟，核mRNA输出和mRNA稳定性和翻译（Glisovic et al。，2008） ）。目前有几种方法可用于鉴定与特定RBP结合的RNA;一些仅在体外检测重组分子，其他检测重组和内源性分子，而其他检测仅内源性分子。实例包括通过指数富集（SELEX），生物素化RNA下拉测定，RNA免疫沉淀（RIP）测定，电泳迁移率变动测定（EMSA），RNA足迹分析和各种UV交联和免疫沉淀（CLIP）方法如CLIP ，PAR-CLIP和iCLIP（Popova等人，2015）。在这里，我们描述了一种简单而有信息的方法来研究和鉴定RBP与其目标转录物之间相互作用的RNA区域（Panda等人，2014和2016）。其重现性和易用性使得该方案成为识别RBP与特异性RNA之间相互作用的快速有效的方法。
背景 RNA蛋白相互作用严重影响基因表达模式。这些核糖核蛋白（RNP）复合物的鉴定对于理解由RNA结合蛋白（RBP）控制的调控机制是必不可少的。最近，广泛的努力导致了开发用于系统分析RNA-蛋白质相互作用的方法。识别RNP复合物的高度信息化方法包括许多不同类型的RNP免疫沉淀（IP）分析。 ...
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