| Protein Expression and Purification of the Hsp90-Cdc37-Cdk4 Kinase Complex from Saccharomyces cerevisiae
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Author:
Date:
2017-10-05
[Abstract] Interactions between Hsp90, its co-chaperone Cdc37 and kinases have been biochemically studied for over three decades and have been shown to be functionally important in organisms from yeast to humans. However, formation of a stable complex for structural studies has been elusive. In this protocol we describe expression and purification of Hsp90-Cdc37-Cdk4 kinase protein complex from Saccharomyces cerevisiae utilizing the viral 2A sequences to titrate the three proteins at similar levels.
[摘要] Hsp90，其伴侣伴侣Cdc37和激酶之间的相互作用已经在三十多年的生物化学研究中被证明在酵母与人类的生物体内在功能上是重要的。 然而，形成一个稳定的结构研究复合物是难以捉摸的。 在该方案中，我们描述了利用病毒2A序列以相似水平滴定三种蛋白质的来自酿酒酵母的Hsp90-Cdc37-Cdk4激酶蛋白复合物的表达和纯化。
【背景】Hsp90分子伴侣与其客体激酶之间的稳定形成复合物已经被证明在体外是难治性的。以前的工作表明，Hsp90的共伴伴Cdc37与昆虫Sf9细胞中的客体激酶的过表达导致Sf9 Hsp90，外源Cdc37和外源激酶（Vaughan等人，2006）之间的稳定复合物。然而，昆虫细胞培养需要特殊的设备，比其他研究较好的表达系统（如细菌和酵母）要难以进行遗传操作，并且显着较慢地生长和克隆。上述蛋白质在E中的共表达。大肠杆菌不产生可溶性激酶/稳定复合物。我们认为，酿酒酵母将具有必要的机制来帮助折叠和促进复合物的形成，并试图通过共同表达这些蛋白质来产生人Hsp90β，人Cdc37和人Cdk4激酶之间的复合物， S上。酵母。为了获得三种蛋白质的化学计量表达，我们利用病毒2A肽，其允许三个蛋白质在一个mRNA上转录，随后在翻译阶段切割。该系统已被用于人类细胞系和兔网状细胞（Kim等人，2011; ...
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| Expression and Purification of Mini G Proteins from Escherichia coli
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Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] Heterotrimeric G proteins modulate intracellular signalling by transducing information from cell surface G protein-coupled receptors (GPCRs) to cytoplasmic effector proteins. Structural and functional characterisation of GPCR–G protein complexes is important to fully decipher the mechanism of signal transduction. However, native G proteins are unstable and conformationally dynamic when coupled to a receptor. We therefore developed an engineered minimal G protein, mini-Gs, which formed a stable complex with GPCRs, and facilitated the crystallisation and structure determination of the human adenosine A2A receptor (A2AR) in its active conformation. Mini G proteins are potentially useful tools in a variety of applications, including characterising GPCR ...
[摘要] 异源三聚体G蛋白通过将细胞表面G蛋白偶联受体（GPCR）的信息转导至细胞质效应蛋白来调节细胞内信号传导。 GPCR-G蛋白复合物的结构和功能表征对于完全破译信号转导机制是重要的。然而，当与受体偶联时，天然G蛋白质是不稳定的并具有构象的动力学。因此，我们开发了一种工程化的最小G蛋白，其与GPCR形成稳定的复合物，促进了人腺苷A 2A受体的结晶和结构测定（A 2AR）的活性构象。 Mini G蛋白是各种应用中潜在有用的工具，包括表征GPCR药理学，结合亲和力和动力学实验，激动剂药物发现和GPCR-G蛋白复合物的结构测定。在这里，我们描述了一个用于表达和纯化mini-G 的详细方案。
我们最近报告了一种工程化的最小G蛋白质（Carpenter和Tate，2016）的开发，其促进了人腺苷A 2A受体的结晶（ A 2 R 2）其活性构象（Carpenter等人，2016; Carpenter和Tate，2017）。不同于需要在真核系统中表达的异源三聚体G蛋白质，在大肠杆菌（大肠杆菌）中高度表达微型G蛋白，并且可以可以容易地纯化，每升培养物的产量为50-100mg的mini-G 。在这里，我们描述了早先在Carpenter和Tate（2016）中描述的可以用于前面描述的任何一种迷你G蛋白构建体的表达和纯化的逐步方案（Carpenter等人， ...
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| Mouse Model of Dengue Virus Infection with Serotypes 1 and 2 Clinical Isolates
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Author:
Date:
2016-12-05
[Abstract] Dengue is a global public health threat caused by infection with any of the 4 related dengue virus serotypes (DENV1-4). Clinical manifestations range from self-limiting febrile illness, known as dengue fever (DF), to life-threatening severe diseases, such as dengue hemorrhagic fever (DHF) or dengue shock syndrome (DSS). Most cases of DHF/DSS are associated with secondary heterotypic infections through a phenomenon that is described as antibody-dependent enhancement of infection (ADE). There are an estimated 400 million human infections and several hundred thousand cases of severe dengue occurring yearly. At present, however, there are no approved antiviral drugs against DENV infection. The lack of a suitable animal model has hampered the evaluation of novel antiviral candidates for DENV ...
[摘要] 登革热是由4种相关登革热病毒血清型（DENV1-4）的任一种感染引起的全球公共卫生威胁。临床表现的范围从自限性发热疾病，称为登革热（DF），到危及生命的严重疾病，如登革热出血热（DHF）或登革热休克综合征（DSS）。大多数DHF/DSS病例通过描述为抗体依赖性增强感染（ADE）的现象与继发性异型感染相关。估计每年有4亿人感染和数十万例严重登革热病例。然而，目前，还没有批准的抗DENV感染的抗病毒药物。缺乏合适的动物模型阻碍了DENV感染的新抗病毒候选物的评价。由于DENV在免疫活性小鼠中不良地建立感染，已将AG129小鼠（缺乏I型和II型IFN [干扰素]受体）和小鼠适应的DENV2株应用于能够繁殖人类感染的几种主要病理的登革动物模型。最近，我们开发了具有临床分离株DENV1和DENV2的新的小鼠模型，其将用于药物测试和登革热发病机理研究（Watanabe等人，2016）。在这里我们描述建立临床分离株的登革热小鼠模型的细节;从体外材料制备到体内病毒感染。值得注意的是，由于DENV在小鼠中的感染性在病毒株之间不同，不是所有临床分离株都可以诱导严重的登革热。
关键字：登革热病毒，致命的小鼠模型，临床病毒，病毒感染的抗体依赖性增强，药物测试
[背景] 为了克服DENV在啮齿动物细胞中不能很好复制的缺点，多年来已经进行了许多努力来开发模拟人类登革热感染的小动物模型。近交小鼠模型系统允许实验可变性最小化，并且遗传工程小鼠模型能够再现动物中登革热临床症状的一些方面。过去的研究显示，用DENV2临床分离物感染的AG129小鼠（缺乏I型和II型IFN受体）感染瘫痪的迹象，这是中枢神经系统受累的病症，在人类病例中是罕见的（Shresta等人。，2004）。或者，产生可在AG129小鼠中诱导人类DHF/DSS样疾病的小鼠适应的DENV2毒株，并已用于登革热研究（Shresta等人，2006; ...
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