| Optogenetic Tuning of Protein-protein Binding in Bilayers Using LOVTRAP
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Author:
Date:
2020-09-05
[Abstract] Modern microscopy methods are powerful tools for studying live cell signaling and biochemical reactions, enabling us to observe when and where these reactions take place from the level of a cell down to single molecules. With microscopy, each cell or molecule can be observed both before and after a given perturbation, facilitating better inference of cause and effect than is possible with destructive modes of signaling quantitation. As many inputs to cell signaling and biochemical systems originate as protein-protein interactions near the cell membrane, an outstanding challenge lies in controlling the timing, location and the magnitude of protein-protein interactions in these unique environments. Here, we detail our procedure for manipulating such spatial and temporal protein-protein ...
[摘要] [摘要] 现代显微镜方法是研究活细胞信号转导和生化反应的强大工具，使我们能够观察这些反应的时间和位置，从细胞水平到单个分子。利用显微镜，可以在给定的扰动之前和之后观察每个细胞或分子，比起破坏性的信号定量方法，可以更好地推断因果关系。由于细胞信号传导和生化系统的许多输入源于细胞膜附近的蛋白质-蛋白质相互作用，因此一个巨大的挑战在于控制时间，位置 以及这些独特环境中蛋白质与蛋白质相互作用的程度。在这里，我们详细介绍了在封闭的显微镜系统中使用这种基于时空的蛋白质-蛋白质相互作用系统，在支持的脂质双分子层上使用基于LOVTRAP的光反应性蛋白质-蛋白质相互作用系统的程序。系统可以在几秒钟内做出响应，并且可以将细节图案化到1微米级别。我们使用了该技术来解锁T细胞信号传导的基本方面，并且该方法可推广到许多其他细胞信号传导和生化环境。
背景技术细胞信号传导和细胞生物学中的问题通常集中在细胞如何感知和响应其环境上。进行这些细胞决定的信号级联反应包含的蛋白质可以在几秒钟到几分钟的时间内将纳米级移动到微米级。某些常用方法，例如蛋白质印迹，qPCR ...
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| Artificial Inoculation of Epichloë festucae into Lolium perenne, and Visualisation of Endophytic and Epiphyllous Fungal Growth
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Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] Natural hosts for the fungal endophyte Epichloë festucae include Festuca rubra (fine fescue) and Festuca trachyphylla (hard fescue). Some strains also form stable associations with Lolium perenne (perennial ryegrass). L. perenne is a suitable host to study fungal endophyte–grass interactions, such as endophytic fungal growth within the plant and epiphyllous growth on the plant surface. Here we provide a detailed protocol based on work by, for artificial inoculation of E. festucae into L. perenne, and newly developed staining and visualization techniques for observing endophytic and epiphyllous hyphae and the expressorium, an appressorium-like structure used by the fungus to exit the plant. The staining method uses a combination of ...
[摘要] 真菌内生菌Epichloëfestucae的天然宿主包括 Festuca rubra （细羊茅）和 Festuca trachyphylla （硬羊茅）。一些菌株也与黑麦草（多年生黑麦草）形成稳定的关联。 升。 perenne 是研究真菌内生菌 - 草相互作用的合适宿主，例如植物内生真菌生长和植物表面的叶生生长。在这里，我们提供了一个基于工作的详细协议，用于 E的人工接种。 festucae 进入 L. perenne ，以及新开发的染色和可视化技术，用于观察内生和附生的菌丝和表达菌，这是一种类似真菌的结构，用于离开植物。染色方法使用葡聚糖结合苯胺蓝二铵盐（AB）和几丁质结合小麦胚凝集素缀合的Alexa Fluor ® 488-（WGA-AF488）的组合。该协议将是研究Epichloë -grass相互作用的有用工具，特别是不同Epichloë - 草关联，各种内生菌 - 宿主发育阶段的比较，以及分析突变Epichloë菌株。
【背景】Latch和Christensen（1985）开发了一种用Epichloë内生菌人工感染草的方案。这项工作一直是广泛的 E的基础。 festucae Fl1- L. perenne 共生研究（Scott et al。，2012年综述）。在我们最近的工作中，我们描述了一种新发现的真菌结构，即能够实现 E的表达式。 ...
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| Preparation of Lipid-Stripped Serum for the Study of Lipid Metabolism in Cell Culture
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Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] Studying lipid metabolism in cultured cells is complicated by the fact that cells are typically cultured in the presence of animal serum, which contains a wide, variable, and undefined variety of lipid species. Lipid metabolism can impact cell physiology, signaling, and proliferation, and the ability to culture cells in the absence of exogenous lipids can reveal the importance of lipid biosynthesis pathways and facilitate the generation of media with defined lipid species. We have adapted a protocol to remove lipids from serum without eliminating its ability to support the proliferation of cells in culture. This method requires di-isopropyl ether and butanol and can be used to generate small batches of lipid-stripped serum in four days. The resulting serum supports proliferation of many ...
[摘要] 研究培养细胞中的脂质代谢很复杂，因为细胞通常在动物血清存在的情况下进行培养，动物血清含有广泛的，可变的和不确定的脂质种类。 脂质代谢可以影响细胞生理学，信号传导和增殖，并且在不存在外源脂质的情况下培养细胞的能力可以揭示脂质生物合成途径的重要性并促进具有限定的脂质物种的培养基的生成。 我们已经调整了一个方案，以去除血清中的脂质，而不消除其支持培养物中细胞增殖的能力。 该方法需要二异丙醚和丁醇，并且可以在四天内用于生成小批量的脂质剥离血清。 所得血清支持培养中许多细胞系的增殖，并且可用于比较脂质充足和贫化条件下细胞的代谢。
【背景】脂质是细胞膜的主要成分，其描绘生物区室，并且在信号传导途径和能量储存中发挥重要作用（Baenke等人，2013）。脂质代谢在多种疾病中失调，最近的研究表明破坏脂质生物合成可能是抑制肿瘤生长的一种方法（Svensson和Shaw，2016）。因此，有兴趣研究产生细胞脂质物种的代谢途径。在没有特定代谢组分的培养基中培养细胞可以帮助更好地理解代谢途径如何支持细胞功能。大多数哺乳动物细胞的标准培养基包括动物血清作为蛋白质和生长因子（最常见的是胎牛血清[FBS]）的来源。动物血清在脂蛋白复合物中含有多种脂质物质并与血清白蛋白结合。不同批次的动物血清组成不同，在大多数实验中血清中的营养物质水平没有明确定义。细胞能够从合成和外源来源获得脂质（Kamphorst等人，2013; ...
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