| Expression and Purification of the Cas10-Csm Complex from Staphylococci
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Author:
Date:
2017-06-05
[Abstract] CRISPR-Cas (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated proteins) is a class of prokaryotic immune systems that degrade foreign nucleic acids in a sequence-specific manner. These systems rely upon ribonucleoprotein complexes composed of Cas nucleases and small CRISPR RNAs (crRNAs). Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus are bacterial residents on human skin that are also leading causes of antibiotic resistant infections (Lowy, 1998; National Nosocomial Infections Surveillance, 2004; Otto, 2009). Many staphylococci possess Type III-A CRISPR-Cas systems (Marraffini and Sontheimer, 2008; Cao et al., 2016), which have been shown to prevent plasmid transfer and protect against viral predators (Goldberg et al., ...
[摘要] CRISPR-Cas（聚集的定期间隔的短回文重复-CRISPR相关蛋白）是一类以序列特异性方式降解外来核酸的原核免疫系统。这些系统依赖于由Cas核酸酶和小型CRISPR RNA（crRNA）组成的核糖核蛋白复合物。表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌是人皮肤上的细菌居民，也是抗生素抗性感染的主要原因（Lowy，1998; National Nosocomial Infection Surveillance，2004; Otto，2009） 。许多葡萄球菌具有III型A CRISPR-Cas系统（Marraffini和Sontheimer，2008; Cao等人，2016），已被证明可预防质粒转移并防止病毒性捕食者（Goldberg这些生物体中，等等，2014; Hatoum-Aslan等人，2014; Samai等人，2015）。因此，在天然葡萄球菌背景中获得对这些系统的机械理解可以导致对影响这些病原体的进化和存活的因素的重要见解。 III-A型CRISPR-Cas系统编码称为Cas10-Csm的五亚单位效应复合物（Hatoum-Aslan等人，2013）。在这里，我们描述了一种用于表达和纯化Cas10-Csm的方法。表皮样背景或异源性S。金黄色葡萄球菌背景。该方法由两步纯化方案组成，包括Ni 2 + - ...
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| Use of Geminivirus for Delivery of CRISPR/Cas9 Components to Tobacco by Agro-infiltration
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] CRISPR/Cas9 system is a recently developed genome editing tool, and its power has been demonstrated in many organisms, including some plant species (Wang et al., 2016). In eukaryotes, the Cas9/gRNA complexes target genome sites specifically and cleave them to produce double-strand breaks (DSBs), which can be repaired by non-homologous end joining (NHEJ) pathway (Wang et al., 2016). Since NHEJ is error prone, mutations are thus generated. In plants, delivery of genome editing reagents is still challenging. In this protocol, we detail the procedure of a virus-based gRNA delivery system for CRISPR/Cas9 mediated plant genome editing (VIGE). This method offers a rapid and efficient way to deliver gRNA into plant cells, especially for those that are recalcitrant to ...
[摘要] CRISPR / Cas9系统是最近开发的基因组编辑工具，其功能已被证实在许多生物体中，包括一些植物物种（Wang等人，2016）。 在真核生物中，Cas9 / gRNA复合物特异性地靶向基因组位点并切割它们以产生双链断裂（DSB），其可以通过非同源末端连接（NHEJ）途径修复（Wang等人， 。，2016）。 由于NHEJ易出错，因此产生突变。 在植物中，基因组编辑试剂的递送仍然是挑战性的。 在本协议中，我们详细介绍了CRISPR / Cas9介导的植物基因组编辑（VIGE）的基于病毒的gRNA传递系统的过程。 该方法提供了将gRNA递送到植物细胞中的快速且有效的方式，特别是对于那些难以转基因农杆菌的方法。
已经报道了基于病毒的基因组编辑技术使用解构DNA病毒和RNA病毒（Baltes等人，2014; Ali等人，2015）。 最近，我们使用了一种完整的双因素病毒 - 卷心菜叶卷曲病毒（CaLCuV）（一种感染广西芥菜科的成员，包括花椰菜的二分酵母病毒），用于高效率 第一次（Yin等人，2015年），其主机之一的基因组编辑（Nicotiana benhamiana）首次进行基因组编辑。
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| Aggregation Prevention Assay for Chaperone Activity of Proteins Using Spectroflurometry
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Author:
Date:
2017-01-20
[Abstract] The ability to stabilize other proteins against thermal aggregation is one of the major characteristics of chaperone proteins. Molecular chaperones bind to nonnative conformations of proteins. Folding of the substrate is triggered by a dynamic association and dissociation cycles which keep the substrate protein on track of the folding pathway (Figure 1). Usually molecular chaperones exhibit differential affinities with different conformations of the substrate. With the exception of the sHsp family of molecular chaperones, the shift from a high-affinity binding state to the low-affinity release state is triggered by ATP binding and hydrolysis (Haselback and Buchner, 2015). Aggregation prevention assay is a simple, yet definitive assay to determine the chaperone activity of heat labile ...
[摘要] 稳定其他蛋白质抵抗热聚集的能力是伴侣蛋白质的主要特征之一。分子伴侣与蛋白质的非构象构象结合。通过动态关联和解离循环来触发底物的折叠，这些循环使底物蛋白保持在折叠通路上（图1）。通常分子伴侣表现出与底物不同构象的差异亲和力。除了分子伴侣的sHsp家族之外，从高亲和力结合状态向低亲和力释放状态的转变由ATP结合和水解引发（Haselback和Buchner，2015）。聚集预防测定是一种简单但尚未确定的测定法，用于确定热不稳定蛋白质如麦芽糖糊精葡糖苷酶（MalZ），柠檬酸盐合酶（CS）和Nde I的伴侣活性。这是基于具有伴侣相似活性的蛋白质预防来自热聚集的蛋白质底物（MalZ，CS和Nde I）的前提。在这里，我们描述了使用我们实验室鉴定的两种不同伴侣蛋白，抵抗素和MoxR1的聚合预防测定的详细方案。分析抗性蛋白（hRes）和MoxR1 a结核分枝杆菌蛋白质对预防MalZ /柠檬酸合酶（CS）/ Nde I聚集的影响。
背景 ![]()
图1.分子伴侣的作用机制。柠檬酸合酶通过越来越多的结构化中间体（I <1>，2 ...
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