| Detection of Protein Interactions in the Cytoplasm and Periplasm of Escherichia coli by Förster Resonance Energy Transfer
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Author:
Date:
2018-01-20
[Abstract] This protocol was developed to qualitatively and quantitatively detect protein-protein interactions in Escherichia coli by Förster Resonance Energy Transfer (FRET). The described assay allows for the previously impossible in vivo screening of periplasmic protein-protein interactions. In FRET, excitation of a donor fluorescent molecule results in the transfer of energy to an acceptor fluorescent molecule, which will then emit light if the distance between them is within the 1-10 nm range. Fluorescent proteins can be genetically encoded as fusions to proteins of interest and expressed in the cell and therefore FRET protein-protein interaction experiments can be performed in vivo. Donor and acceptor fluorescent protein fusions are constructed for bacterial proteins ...
[摘要] 该协议的开发是通过Förster共振能量转移（FRET）定性和定量检测大肠杆菌中的蛋白质 - 蛋白质相互作用。所描述的测定允许以前不可能的周质蛋白质 - 蛋白质相互作用的体内筛选。在FRET中，供体荧光分子的激发导致能量转移到受体荧光分子，如果它们之间的距离在1-10nm范围内，则受体荧光分子将发光。荧光蛋白质可以被遗传编码为与感兴趣的蛋白质的融合物并且在细胞中表达，因此FRET蛋白质 - 蛋白质相互作用实验可以在体内进行。供体和受体荧光蛋白融合体被构建用于被怀疑相互作用的细菌蛋白质。这些融合蛋白在细菌细胞中共表达，随后激发供体和受体通道测量荧光发射光谱。供体的发射光谱与受体的激发光谱之间的部分重叠是FRET的先决条件。即使在没有FRET的情况下，供体激发也可以使受体以已知百分比交叉激发。通过测量背景，仅供体和仅受体样品的参考光谱，可以计算预期的发射光谱。在预期光谱之上的受体的致敏发射可以归因于FRET，并且可以通过光谱解混来量化。
【背景】确定如何和哪些蛋白质相互作用维持生命是分子生物学研究的核心。存在许多体外方法，但可能导致误报，因为相互作用是从其生物学背景中取出的。 ...
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| Single-step Marker Switching in Schizosaccharomyces pombe Using a Lithium Acetate Transformation Protocol
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Author:
Date:
2016-12-20
[Abstract] The ability to utilize different selectable markers for tagging or mutating multiple genes in Schizosaccharomyces pombe is hampered by the historical use of only two selectable markers, ura4+ and kanMX6; the latter conferring resistance to the antibiotic G418 (geneticin). More markers have been described recently, but introducing these into yeast cells often requires strain construction from scratch. To overcome this problem we and other groups have created transformation cassettes with flanking homologies to ura4+ and kanMX6 which enable an efficient and time-saving way to exchange markers in existing mutated or tagged fission yeast strains.
Here, we present a protocol for single-step marker switching by ...
[摘要] 利用不同的选择标记来标记或突变粟酒裂殖酵母中的多个基因的能力受到仅仅两种可选择标记的历史使用的阻碍，即 +和 kanMX6 ;后者赋予抗生素G418（遗传霉素）抗性。最近已经描述了更多的标记物，但是将它们引入酵母细胞通常需要从头开始施加应变。为了克服这个问题，我们和其他团队已经创建了具有与 + 和 kanMX6 的侧翼同源性的转换盒，这使得能够有效和省时的方式在现有的突变或标记的裂变酵母菌株中交换标记。
＆nbsp;在这里，我们提出了裂殖酵母，粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中醋酸锌转化的单步标记转换方案。以下我们将介绍如何将 ura4 + 标记交换到kanMX6 ， natMX4 或 hphMX4标记，其分别对抗生素G418，海参（clonNAT）或潮霉素B提供抗性。我们还详细介绍了如何交换营养标记的任何 MX 标记，例如 arg3 + ， his3 + ， leu1 + 和 ura4 + 。
背景 这种用于粟酒裂殖酵母的单步骤标记交换方案允许将标记有类型的抗生素标记的任何标记或突变的基因替换为营养标记物（含有arg3 + ， + ，并且已经构建了 ura4 + ）并且为任何 MX交换遗传 ura4 + ...
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