| Reduced Representation Bisulfite Sequencing in Maize
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] DNA methylation is an epigenetic modification that regulates plant development (Law and Jacobsen, 2010). Whole genome bisulfite sequencing (WGBS) is a state-of-the-art method for profiling genome-wide methylation patterns with single-base resolution (Cokus et al., 2008). However, for an organism with a large genome, e.g., the 2.1 Gb genome of maize, WGBS may be very expensive. Reduced representation bisulfite sequencing (RRBS) has been developed in mammalian studies (Smith et al., 2009). By digesting the genome with MspI with a size selection range of approximately 40-220 bp, CG-rich regions covering only ~1% of the human genome can be specifically sequenced. However, unlike mammalian genomes, plant genomes do not exhibit clear CpG islands. Therefore ...
[摘要] DNA甲基化是调节植物发育的表观遗传修饰（Law and Jacobsen，2010）。全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）是用单碱基分辨率分析全基因组甲基化模式的最先进的方法（Cokus et al。，2008）。然而，对于具有大基因组的生物体，例如玉米的2.1Gb基因组，WGBS可能非常昂贵。代表性亚硫酸氢盐测序（RRBS）已经在哺乳动物研究中发展（Smith等人，2009）。通过用大小选择范围大约40-220bp的 Msp 消化基因组，可以对仅涵盖〜1％人类基因组的CG富含区域进行特异性测序。然而，与哺乳动物基因组不同，植物基因组不显示清楚的CpG岛。因此原来的RRBS协议不适用于工厂。因此，我们开发了一种计算机管道来选择特定的酶以生成感兴趣区域（ROI） - 富集的，例如，富含启动子的，减少的植物表达基因组（例如， Hsu et al。，2017）。通过用MseI消化玉米基因组并选择40-300bp片段，我们测序了大约四分之一的玉米基因组，同时保留了84.3％的启动子信息。该协议已在玉米中成功建立，可广泛应用于任何基因组。我们的计算机管道系统与RRBS文库制备方案相结合，允许进行计算分析和实验验证。
【背景】DNA甲基化是一种可遗传的表观遗传修饰，通过调节基因表达和染色质结构在动物，植物和真菌的许多发育过程中发挥重要作用（Law and ...
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| Knock-in Blunt Ligation Utilizing CRISPR/Cas9
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Author:
Date:
2017-03-05
[Abstract] The incorporation of the CRISPR/Cas9 bacterial immune system into the genetic engineering toolbox has led to the development of several new methods for genome manipulation (Auer et al., 2014; Byrne et al., 2015). We took advantage of the ability of Cas9 to generate blunt-ended double-strand breaks (Jinek et al., 2012) to introduce exogenous DNA in a highly precise manner through the exploitation of non-homologous end-joining DNA repair machinery (Geisinger et al., 2016). This protocol has been successfully applied to traditional immortalized cell lines and human induced pluripotent stem cells. Here we present a generalized protocol for knock-in blunt ligation, using HEK293 cells as an example.
[摘要] 将CRISPR / Cas9细菌免疫系统并入基因工程工具箱已经导致了几种用于基因组操作的新方法的开发（Auer等人，2014; Byrne等人，2015）。我们利用Cas9产生平端双链断裂的能力（Jinek等人，2012），以高度精确的方式通过开发非同源末端引物来引入外源DNA，加入DNA修复机械（Geisinger等人，2016）。该方案已成功应用于传统的永生化细胞系和人诱导多能干细胞。在这里，我们提出了使用HEK293细胞作为例子的敲入钝性连接的一般化方案。
背景 当我们概念化敲门钝性结扎（Geisinger等人，2016）时，开发用于CRISPR / Cas9的绝大多数方法都集中在提高同源重组的效率。然而，有一个例外：在斑马鱼中开发的同源性独立的基于质粒的敲入方法（Auer等人，2014）。这种方法，如敲入钝性连接，依赖于典型的非同源末端连接的机制，以线性化的，平端的双链DNA片段以高精度插入到基因组双链断裂中，核苷酸损失最小。这两种方法类似于为锌指核酸酶和被称为专性连接门控重组的TALEN开发的方法（ObLiGaRe; Maresca等人，2013），其依赖于产生相容的突出端以促进将靶DNA插入基因组。 ...
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| In vitro Drug Susceptibility Assay for HBV Using Southern Blotting
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Author:
Date:
2015-04-20
[Abstract] Antiviral agents for the suppression of hepatitis B virus (HBV) have been used for treating chronic hepatitis B. However, the emergence of drug-resistant HBV is still a major problem for antiviral treatment. To identify and characterize the drug-resistant HBV, the construction of HBV replicon and in vitro drug susceptibility assay are essential. Here we describe the experimental methods to study drug-resistant HBV.
[摘要] 用于抑制乙型肝炎病毒（HBV）的抗病毒剂已经用于治疗慢性乙型肝炎。然而，耐药性HBV的出现仍然是抗病毒治疗的主要问题。 为了鉴定和表征耐药性HBV，构建HBV复制子和体外药物敏感性测定是必需的。 在这里我们描述研究耐药性HBV的实验方法。
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