| Production, Purification and Crystallization of a Prokaryotic SLC26 Homolog for Structural Studies
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Author:
Date:
2017-02-05
[Abstract] The SLC26 or SulP proteins constitute a large family of anion transporters that are ubiquitously expressed in pro- and eukaryotes. In human, SLC26 proteins perform important roles in ion homeostasis and malfunctioning of selected members is associated with diseases. This protocol details the production and crystallization of a prokaryotic SLC26 homolog, termed SLC26Dg, from Deinococcus geothermalis. Following these instructions we obtained well-folded and homogenous material of the membrane protein SLC26Dg and the nanobody Nb5776 that enabled us to crystallize the complex and determine its structure (Geertsma et al., 2015). The procedure may be adapted to purify and crystallize other membrane protein complexes.
[摘要] SLC26或SulP蛋白构成在亲和真核生物中普遍表达的大量阴离子转运蛋白。在人类中，SLC26蛋白在离子稳态中起重要作用，选择成员的功能障碍与疾病有关。该方案详细描述了来自地热异常球菌的原核SLC26同源物（称为SLC26Dg）的产生和结晶。按照这些说明，我们获得了膜蛋白SLC26Dg和纳米体Nb5776的良好折叠和均匀的材料，使我们能够使复合物结晶并确定其结构（Geertsma等人，2015）。该方法可以适于纯化和结晶其它膜蛋白复合物。
背景 除了少数例外，膜蛋白的结构表征涉及蛋白质生产水平，洗涤剂溶解状态下的稳定化和结晶的挑战。克服这些障碍所采取的策略取决于有效选择具有优异生物化学性质的SLC26同系物和使用抗体作为结晶伴侣（Geertsma等人，2015）。这里描述的程序并没有大大偏离同事的程序，但在几点上，我们采用其他方法。例如，对于蛋白质生产，我们利用araBAD启动子（Guzman等人，1995），而不是流行的T7启动子（Studier等人，1990）。与T7启动子相反，PAD启动子允许直接调节蛋白质生产水平及其对下游折叠机械的能力的调节，从而减少包涵体的形成（Geertsma， et ...
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| Heterologous Expression and Purification of the Magnesium Transporter A (MgtA) in Escherichia coli
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Author:
Date:
2016-11-20
[Abstract] The magnesium transporter A (MgtA) is a magnesium transporting P-type ATPase present in prokaryotes and plants (Subramani et al., 2016). In Salmonella typhimurium and Escherichia coli (E. coli), MgtA is expressed only in magnesium limiting conditions and plays an important role in Mg2+ homeostasis (Groisman et al., 2013). The transcription of mgtA is regulated by the two-component system PhoP/PhoQ (Soncini et al., 1996; Kato et al., 1999). The membrane bound histidine kinase, PhoQ, senses low Mg2+ concentration in the periplasmic space and phosphorylates its cognate response regulator, PhoP, which initiates mgtA transcription (Groisman et al., 2013). MgtA is targeted to the ...
[摘要] 镁转运蛋白A（MgtA）是存在于原核生物和植物中的镁转运P型ATP酶（Subramani等，2016）。在鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌（Escherichia coli）（大肠杆菌）中，MgtA仅在镁限制条件下表达，并在Mg2 +稳态中起重要作用（Groisman等，2013）。 mgtA的转录由双组分系统PhoP / PhoQ（Soncini等人，1996; Kato等，1999）调节。膜结合的组氨酸激酶PhoQ感测周质空间中的低Mg2 +浓度，并磷酸化其启动mgtA转录的同源反应调节因子PhoP（Groisman等，2013）。通过将Mg2 +导入细胞质，MgtA靶向质膜并促进低Mg2 +条件下的细菌存活。矮牵牛的MgtA同源物（PH1）在液泡膜中发现，涉及花瓣的着色（Faraco等，2014）。作为理解MgtA Mg2 +转运的分子细节的第一步，我们描述了可用于生物化学和生物物理学研究的大肠杆菌MgtA的纯化的详细方案。在大肠杆菌DH5α中克隆了在N末端具有六氨基组氨酸标签的重组大肠杆菌MgtA，并在大肠杆菌C43（DE3）中通过发酵至OD> 6进行表达。细胞裂解在高压均化器并通过超速离心分离膜。用洗涤剂十二烷基-β-D麦芽糖苷溶解膜蛋白质。通过亲和力和尺寸排阻色谱纯化MgtA。纯化的MgtA的最终产量每3g湿细胞沉淀达到〜1mg MgtA。
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