| Thermostability Measurement of an α-Glucosidase Using a Classical Activity-based Assay and a Novel Thermofluor Method
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] α-glucosidases (including maltases and isomaltases) are enzymes which release glucose from a set of α-glucosidic substrates. Their catalytic activity, substrate specificity and thermostability can be assayed using this trait. Thermostability of proteins can also be determined using a high-throughput differential scanning fluorometry method, also named Thermofluor. We have shown that Thermofluor can also be applied to predict binding of substrates and inhibitors to a yeast α-glucosidase. The methods described here in detail were used in Viigand et al., 2016.
[摘要] α-葡糖苷酶（包括麦芽糖酶和异麦芽糖酶）是从一组α-葡糖苷底物释放葡萄糖的酶。 可以使用该特征来测定其催化活性，底物特异性和热稳定性。 蛋白质的热稳定性也可以使用高通量差示扫描荧光测定法（也称为Thermofluor）来测定。 我们已经表明，Thermofluor也可以应用于预测底物和抑制剂与酵母α-葡萄糖苷酶的结合。 这里详细描述的方法用于Viigand等人，2016。
【背景】麦芽糖酶（EC 3.2.1.20）和异麦芽糖酶（EC 3.2.1.10）是根据CAZy分类属于糖苷水解酶家族13的α-葡糖苷酶（Lombard等，2014）。甲基营养酵母多形汉酵母的麦芽糖酶MAL1是非选择性的，它将产生D-葡萄糖的麦芽糖和异麦芽糖状α-葡萄糖苷水解为反应产物之一。因此，麦芽糖酶对其底物的活性可以根据葡萄糖释放来确定。该工作描述的葡萄糖液色辅助方法可以快速方便地测定麦芽糖酶的活性，底物特异性和热稳定性。重要的是，这种基于活性的方法可以适用于产生葡萄糖作为反应产物的其它酶。高通量Thermofluor方法主要用于蛋白质晶体学测量（热）稳定性蛋白质（Boivin等，2013; Ericsson等，2006）。我们使用Thermofluor ...
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| Chromatin Immunoprecipitation Experiments from Whole Drosophila Embryos or Larval Imaginal Discs
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Author:
Date:
2017-06-05
[Abstract] Chromatin Immunoprecipitation coupled either to qPCR (qChIP) or high-throughput sequencing (ChIP-Seq) has been extensively used in the last decades to identify the DNA binding sites of transcription factors or the localization of various histone marks along the genome. The ChIP experiment generally includes 7 steps: collection of biological samples (A), cross-linking proteins to DNA (B), chromatin isolation and fragmentation by sonication (C), sonication test (D), immunoprecipitation with antibodies against the protein or the histone mark of interest (E), DNA recovery (E), identification of factor-associated DNA sequences by PCR or sequencing (F). The protocol described here can readily be used for ChIP-seq and ChIP-qPCR experiments. The entire procedure, describing experimental setup ...
[摘要] 与qPCR（qChIP）或高通量测序（ChIP-Seq）相结合的染色质免疫沉淀已被广泛用于识别转录因子的DNA结合位点或基因组中各种组蛋白标记的定位。 ChIP实验通常包括7个步骤：收集生物样品（A），交联蛋白质到DNA（B），染色质分离和通过超声处理分离（C），超声处理测试（D），用针对蛋白质的抗体进行免疫沉淀感兴趣的组蛋白标记（E），DNA回收（E），通过PCR或测序鉴定因子相关DNA序列（F）。这里描述的协议可以容易地用于ChIP-seq和ChIP-qPCR实验。描述在完整的果蝇组织中优化分析的实验设置条件的整个过程可以在四天内完成。
背景 尽管永生化的培养细胞广泛用于研究各种细胞类型的染色质景观，但是在生理条件下在体内探测相互作用的有价值的方法对于进行转录的时间或空间比较分析是必要的因子和组蛋白修饰图在不同阶段的果蝇发展或不同组织之间。在这里，我们提供了一个详细的ChIP协议，已被优化，以便在整个果蝇胚胎和幼虫成像光盘上工作，突出关键的实验参数。
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| Virus Binding and Internalization Assay for Adeno-associated Virus
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Author:
Date:
2017-01-20
[Abstract] The binding and internalization of adeno-associated virus (AAV) is an important determinant of viral infectivity and tropism. The ability to dissect these two tightly connected cellular processes would allow better understanding and provide insight on virus entry and trafficking. In the following protocol, we describe a quantitative PCR (qPCR) based method to determine the amount of vector bound to the cell surface and the amount of subsequent virus internalization based on viral genome quantification. This protocol is optimized for studying AAV. Nevertheless, it can serve as a backbone for studying other viruses with careful modification.
[摘要] 腺相关病毒（AAV）的结合和内化是病毒感染和向性的重要决定因素。 解决这两个紧密相连的细胞过程的能力将有助于更好地了解并提供有关病毒进入和贩运的洞察。 在以下协议中，我们描述了基于定量PCR（qPCR）的方法，以确定基于病毒基因组定量结合到细胞表面的载体的量和随后的病毒内化的量。 该协议针对研究AAV进行了优化。 然而，它可以作为研究其他病毒，仔细修改的骨干。
【背景】评估AAV生物学的研究通常使用转基因表达作为实验终点。 然而，AAV在到达细胞核并转导细胞之前必须成功导航的许多关键步骤。 因此，AAV感染途径中有多个不同的步骤可能会单独或共同破坏，导致改变的转导。 AAV结合和内化的评估是确定小分子细胞修饰，基于CRISPR的基因敲除，基于siRNA的基因敲除或其他实验程序后观察到的转导差异的原因的重要的第一步
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