| Preparation of HeLa Total Membranes and Assay of Lipid-inhibition of Serine Palmitoyltransferase Activity
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Author:
Date:
2020-06-20
[Abstract] Serine palmitoyltranferase (SPT) is a pyridoxal 5′ phosphate (PLP)-dependent enzyme that catalyzes the first and rate-limiting step of de novo synthesis of sphingolipids. SPT activity is homeostatically regulated in response to increased levels of sphingolipids. This homeostatic regulation of SPT is mediated through small ER membrane proteins termed the ORMDLs. Here we describe a procedure to assay ORMDL dependent lipid inhibition of SPT activity. The assay of SPT activity using radiolabeled L-serine was developed from the procedure established by the Hornemann laboratory. The activity of SPT can also be measured using deuterated L-serine but it requires mass spectrometry, which consumes money, time and instrumentation. The ORMDL dependent lipid inhibition of SPT activity can be ...
[摘要] [摘要] 丝氨酸Palmitoyltranferase （SPT）是吡哆醛5 ' 磷酸（PLP）依赖酶催化第一和限速步骤中从头合成鞘脂。SPT活动是Homeostatically调控响应水平的提高鞘脂。这SPT的稳态调节是通过小ER膜蛋白介导称为ORMDLs。在这里，我们描述了一种方法用放射性标记的L-丝氨酸以测定SPT活性的SPT活性。测定的ORMDL依赖性抑制脂质从由规定的程序被开发Hornemann 实验室。 SPT的活性也可以使用氘化的L-丝氨酸进行测定，但需要进行质谱分析，这会耗费金钱，时间和仪器。可以在细胞和无细胞系统中研究ORMDL依赖性脂质对SPT活性的抑制作用。在这里，我们提供了详细的协议来测量存在短链（C8-神经酰胺）或长链神经酰胺（C24-神经酰胺）时SPT活性。该协议的最大优势之一我们通过在HeLa细胞膜中提供外源鞘氨醇和24：1酰基辅酶A通过内源性神经酰胺合酶生成长链神经酰胺来实现这一目标。需要精密的仪器。
[背景 ] 丝氨酸palmit oyltranferase （SPT）是一种多亚基酶是在真核生物和原核生物一些广泛表达（花田等人，1997; Ikushiro 。等人，2001; Hornemann 等人，2007）.The ...
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| The Long-lived Protein Degradation Assay: an Efficient Method for Quantitative Determination of the Autophagic Flux of Endogenous Proteins in Adherent Cell Lines
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Author:
Date:
2018-05-05
[Abstract] Autophagy is a key player in the maintenance of cellular homeostasis in eukaryotes, and numerous diseases, including cancer and neurodegenerative disorders, are associated with alterations in autophagy. The interest for studying autophagy has grown intensely in the last two decades, and so has the arsenal of methods utilised to study this highly dynamic and complex process. Changes in the expression and/or localisation of autophagy-related proteins are frequently assessed by Western blot and various microscopy techniques. Such analyses may be indicative of alterations in autophagy-related processes and informative about the specific marker being investigated. However, since these proteins are part of the autophagic machinery, and not autophagic cargo, they cannot be used to draw ...
[摘要] 自噬是维持真核生物细胞稳态的关键因素，包括癌症和神经退行性疾病在内的许多疾病都与自噬的改变有关。研究自噬的兴趣在过去的二十年里急剧增长，并且还有用于研究这种高度动态和复杂过程的方法库。通常通过Western印迹和各种显微镜技术来评估自噬相关蛋白的表达和/或定位中的变化。这样的分析可能表明自噬相关过程的改变，并且关于正在研究的特定标记物的信息。然而，由于这些蛋白质是自噬机制的一部分，而不是自噬性货物，所以它们不能用于得出关于自噬载货流量的结论。在这里，我们提供了一个协议，通过使用长寿命的蛋白质降解测定来定量评估体积自噬流量。我们的程序追踪14 C缬氨酸标记的蛋白质的降解是简单和快速的，允许并行处理相对大量的样品，并且原则上可以与任何贴壁细胞一起使用线。最重要的是，它可以通过自噬途径定量测量内源货物流量。因此，它是研究自噬活动的黄金标准之一。
【背景】脉冲追踪标记方法已用于研究蛋白质周转数十年。在此处描述的长寿命蛋白质降解（LLPD）测定中，培养细胞的蛋白质组用14 ...
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| Fat Turnover Assay in Drosophila
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Author:
Date:
2016-11-05
[Abstract] Like all animals, Drosophila shows robust fat (triglyceride) turnover, i.e., they synthesize, store and utilize triglyceride for their daily metabolic needs. The protocol describes a simple assay to measure this turnover of triglycerides in Drosophila.
[摘要] 像所有动物一样，果蝇表现出强劲的脂肪（甘油三酯）周转，即，它们合成，储存和利用甘油三酯用于其日常代谢需要。 该方案描述了测量果蝇中甘油三酯转化的简单测定法。 几乎所有的动物都以 糖原和甘油三酯。 许多生理，病理和环境条件引起这些能量储备的总水平的变化，特别是甘油三酯。 然而，并不总是清楚甘油三酯中所导致的变化是由于减少的分解，增加的合成，或反之亦然。 使用此协议，可以确定新合成的甘油三酯在苍蝇中的合成速率和降解。
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