| A Method to Convert mRNA into a Guide RNA (gRNA) Library without Requiring Previous Bioinformatics Knowledge of the Organism
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Author:
Date:
2017-05-20
[Abstract] While the diversity of species represents a diversity of special biological abilities, many of the genes that encode those special abilities in a variety of species are untouched, leaving an untapped gold mine of genetic information; however, despite current advances in genome bioinformatics, annotation of that genetic information is incomplete in most species, except for well-established model organisms, such as human, mouse, or yeast. A guide RNA (gRNA) library using the clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 (CRISPR-associated protein 9) system can be used for the phenotypic screening of uncharacterized genes by forward genetics. The construction of a gRNA library usually requires an abundance of chemically synthesized oligos designed from annotated genes; ...
[摘要] 虽然物种的多样性代表着特殊的生物学能力的多样性，但许多编码这些特殊能力的基因却是不变的，留下了未开发的遗传信息金矿;然而，尽管基因组生物信息学方面取得了进展，但除了成熟的模型生物体，如人，小鼠或酵母，遗传信息的注释在大多数物种中是不完全的。使用聚簇常规散布的回文重复序列（CRISPR）/ Cas9（CRISPR相关蛋白9）系统的引导RNA（gRNA）文库可用于通过正向遗传学对非特异性基因的表型筛选。 gRNA文库的构建通常需要从注释基因设计的大量化学合成寡核苷酸;如果想在没有目标DNA序列的先验知识的情况下将mRNA转换成gRNA，那么主要的挑战就是发现原始邻近基序（PAM）侧翼的序列并切出20-bp片段。最近，我开发了基于分子生物学技术将mRNA转化为gRNA文库（Arakawa，2016）（图1）。我在这里描述了如何从mRNA构建gRNA文库的详细协议。
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图1.将mRNA转化为gRNA文库构建的方法（Sanjana等人，2014）。总结了该方法的方案。在步骤中详细描述了D-O的每个步骤。 ...
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| Efficient AAV-mediated Gene Targeting Using 2A-based Promoter-trap System
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Author:
Date:
2016-12-20
[Abstract] Adeno-associated virus (AAV)-based targeting vectors have 1-4-log higher gene targeting efficiencies compared with plasmid-based targeting vectors. The efficiency of AAV-mediated gene targeting is further increased by introducing a promoter-trap system into targeting vectors. In addition, we found that the use of ribosome-skipping 2A peptide rather than commonly used internal ribosome entry site (IRES) in the promoter-trap system results in significantly higher AAV-mediated gene targeting efficiencies (Karnan et al., 2016). In this protocol, we describe the procedures for AAV-mediated gene targeting exploiting 2A for promoter trapping, including the construction of a targeting vector based on the platform plasmid pAAV-2Aneo or pAAV-2Aneo v2, production of AAV particles, infection ...
[摘要] 与基于质粒的靶向载体相比，基于腺相关病毒（AAV）的靶向载体具有1-4对较高的基因靶向效率。 通过将启动子捕获系统引入靶向载体中，AAV介导的基因靶向的效率进一步增加。 此外，我们发现使用核糖体跳跃2A肽而不是通常使用的内部核糖体进入位点（IRES）在启动子捕获系统中导致显着更高的AAV介导的基因靶向效率（Karnan等，2016）。 在该方案中，我们描述了AAV介导的基因靶向开发2A用于启动子捕获的程序，包括基于平台质粒pAAV-2Aneo或pAAV-2Aneo v2的靶向载体的构建，AAV颗粒的产生，细胞感染 基于AAV的靶向载体，以及基因靶向细胞克隆的分离和验证。
【背景】以前在其他方案中描述了AAV介导的基因靶向的程序（对应于本方案的BG部分）（Kohli等人，2004; Rago等人，2007; Khan等人，2011; Howes and Schofield ，2015）。 然而，该方案提供了如何使用基于2A的启动子捕获系统首次进行AAV介导的基因靶向的详细描述。
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