| Method for CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Candida albicans
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Author:
Date:
2018-04-20
[Abstract] Candida albicans is the most prevalent and important human fungal pathogen. The advent of CRISPR as a means of gene editing has greatly facilitated genetic analysis in C. albicans. Here, we describe a detailed step-by-step procedure to construct and analyze C. albicans deletion mutants. This protocol uses plasmids that allow simple ligation of synthetic duplex 23mer guide oligodeoxynucleotides for high copy gRNA expression in C. albicans strains that express codon-optimized Cas9. This protocol allows isolation and characterization of deletion strains within nine days.
[摘要] 白色念珠菌是最普遍和最重要的人类真菌病原体。 CRISPR作为基因编辑手段的出现极大地促进了 C中的遗传分析。白色假丝酵母。 在这里，我们描述一个详细的分步过程来构建和分析 C。 白色念珠菌缺失突变体。 该协议使用质粒，允许合成的双链体23mer引导寡聚脱氧核苷酸在高拷贝gRNA表达的简单连接。 表达密码子优化的Cas9的白色念珠菌菌株。 该协议允许在9天内分离和鉴定缺失菌株。
【背景】℃。白色念珠菌是一种难以处理遗传的有机体。由于它通常作为不容易进行有性生殖的二倍体存在，所以纯合隐性突变需要对每个基因座进行连续修饰。克隆间规则间隔短回文重复（CRISPR）突变的发展和应用。白色念珠菌促进遗传操作，因为它允许两个等位基因同时突变（Vyas et al。，2015; Min et al。，2016; Ng and Dean，2017 ）。 CRISPR基因编辑涉及将RNA引导的核酸酶募集至邻近NGG原型间隔子邻接基序（PAM）的互补靶位点（Jinek等人，2012; Cong等人， 2013年;马里等人，2013年）。 CRISPR相关（Cas）核酸酶通过与结合Cas9的激活CRISPR RNA（tracrRNA）相关的指导RNA之间的互补碱基配对以高特异性进行靶向（Gasiunas等人， ...
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| CRISPR/Cas9 Editing of the Bacillus subtilis Genome
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Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] A fundamental procedure for most modern biologists is the genetic manipulation of the organism under study. Although many different methods for editing bacterial genomes have been used in laboratories for decades, the adaptation of CRISPR/Cas9 technology to bacterial genetics has allowed researchers to manipulate bacterial genomes with unparalleled facility. CRISPR/Cas9 has allowed for genome edits to be more precise, while also increasing the efficiency of transferring mutations into a variety of genetic backgrounds. As a result, the advantages are realized in tractable organisms and organisms that have been refractory to genetic manipulation. Here, we describe our method for editing the genome of the bacterium Bacillus subtilis. Our method is highly efficient, resulting in ...
[摘要] 大多数现代生物学家的基本过程是研究生物体的遗传操作。尽管许多不同的方法用于编辑细菌基因组已经在实验室中使用了数十年，但CRISPR / Cas9技术对细菌遗传学的适应使得研究人员能够以无与伦比的设施来操纵细菌基因组。 CRISPR / Cas9允许基因组编辑更精确，同时也提高将突变转移到各种遗传背景的效率。因此，在遗传操作难以处理的易处理生物和生物体中实现了这些优点。在这里，我们描述了我们编辑枯草芽孢杆菌细菌基因组的方法。我们的方法是高效的，导致精确，无标记的突变。此外，在产生编辑质粒之后，可以将突变快速导入几个遗传背景，大大增加可进行遗传分析的速度。
枯草芽孢杆菌是高度易处理的革兰氏阳性菌。遗传研究适用于使用多种载体通过同源重组快速有效地引入突变。尽管有许多不同的方法来引入B突变。 subtilis，每种方法都有其局限性。一种简单而简单的方法，用于在B中进行突变。枯草芽孢杆菌是基因破坏，其中将质粒整合到感兴趣的基因内（Vagner等人，1998）。主要的局限性包括：1）扰乱操纵子的极地作用的潜力; 2）引进和保留外来DNA; 3）一旦使用抗生素耐药性盒，如果在其他突变的背景下研究给定的突变，则研究者必须使用不同的盒;和4）该方法限于靶向整个基因，并且不能产生更精确的点突变。 ...
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| Efficient AAV-mediated Gene Targeting Using 2A-based Promoter-trap System
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Author:
Date:
2016-12-20
[Abstract] Adeno-associated virus (AAV)-based targeting vectors have 1-4-log higher gene targeting efficiencies compared with plasmid-based targeting vectors. The efficiency of AAV-mediated gene targeting is further increased by introducing a promoter-trap system into targeting vectors. In addition, we found that the use of ribosome-skipping 2A peptide rather than commonly used internal ribosome entry site (IRES) in the promoter-trap system results in significantly higher AAV-mediated gene targeting efficiencies (Karnan et al., 2016). In this protocol, we describe the procedures for AAV-mediated gene targeting exploiting 2A for promoter trapping, including the construction of a targeting vector based on the platform plasmid pAAV-2Aneo or pAAV-2Aneo v2, production of AAV particles, infection ...
[摘要] 与基于质粒的靶向载体相比，基于腺相关病毒（AAV）的靶向载体具有1-4对较高的基因靶向效率。 通过将启动子捕获系统引入靶向载体中，AAV介导的基因靶向的效率进一步增加。 此外，我们发现使用核糖体跳跃2A肽而不是通常使用的内部核糖体进入位点（IRES）在启动子捕获系统中导致显着更高的AAV介导的基因靶向效率（Karnan等，2016）。 在该方案中，我们描述了AAV介导的基因靶向开发2A用于启动子捕获的程序，包括基于平台质粒pAAV-2Aneo或pAAV-2Aneo v2的靶向载体的构建，AAV颗粒的产生，细胞感染 基于AAV的靶向载体，以及基因靶向细胞克隆的分离和验证。
【背景】以前在其他方案中描述了AAV介导的基因靶向的程序（对应于本方案的BG部分）（Kohli等人，2004; Rago等人，2007; Khan等人，2011; Howes and Schofield ，2015）。 然而，该方案提供了如何使用基于2A的启动子捕获系统首次进行AAV介导的基因靶向的详细描述。
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