| Robust Generation of Knock-in Cell Lines Using CRISPR-Cas9 and rAAV-assisted Repair Template Delivery
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Date:
2017-04-05
[Abstract] The programmable Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-associated nuclease 9 (Cas9) technology revolutionized genome editing by providing an efficient way to cut the genome at a desired location (Ledford, 2015). In mammalian cells, DNA lesions trigger the error-prone non-homologous end joining (NHEJ) DNA repair mechanism. However, in presence of a DNA repair template, Homology-Directed Repair (HDR) can occur leading to precise repair of the lesion site. This last process can be exploited to enable precise knock-in changes by introducing the desired genomic alteration on the repair template. In this protocol we describe the delivery of long repair templates (> 200 nucleotides) using recombinant Adeno Associated Virus (rAAV) for CRISPR-Cas9-based knock-in of a ...
[摘要] 可编程集群定期间隔短回归度（CRISPR）相关核酸酶9（Cas9）技术通过提供在所需位置切割基因组的有效方式，彻底改变了基因组编辑（Ledford，2015）。 在哺乳动物细胞中，DNA损伤触发易发生非同源末端连接（NHEJ）DNA修复机制。 然而，在DNA修复模板的存在下，可以发生同源性定向修复（HDR），导致病变部位的精确修复。 可以利用最后的方法，通过在修复模板上引入所需的基因组改变来实现精确的敲入变化。 在本协议中，我们描述了使用重组腺相关病毒（rAAV）在人细胞系中进行基于CRISPR-Cas9的C-末端标签序列敲入的长修复模板（> 200个核苷酸）的递送。
尽管有关CRISPR-Cas9产生的敲门模型系统的大量报告，敲门砖报告仍然落后。由于许多应用，产生敲入细胞系仍然是基因组编辑的明显目标。敲入改变的引入通常依赖于修复模板DNA的存在，并且在位点特异性双链（ds）DNA断裂被引入接近改变位点的基因组中后，HDR修复机制的激活。不同的模板可以传送到修复机器，范围从含有广泛同源区域和可选选择盒的经典线性化载体到约200个核苷酸的单链（ss）DNA寡核苷酸（Chen等人， ...
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| Multiplexed GuideRNA-expression to Efficiently Mutagenize Multiple Loci in Arabidopsis by CRISPR-Cas9
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Author:
Date:
2017-03-05
[Abstract] Since the discovery of the CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-associated protein (Cas) as an efficient tool for genome editing in plants (Li et al., 2013; Shan et al., 2013; Nekrasov et al., 2013), a large variety of applications, such as gene knock-out, knock-in or transcriptional regulation, has been published. So far, the generation of multiple mutants in plants involved tedious crossing or mutagenesis followed by time-consuming screening of huge populations and the use of the Cas9-system appeared a promising method to overcome these issues. We designed a binary vector that combines both the coding sequence of the codon optimized Streptococcus pyogenes Cas9 nuclease under the control of the Arabidopsis thaliana ...
[摘要] 自从发现CRISPR（聚集的定期交织的短回文重复） - 相关蛋白（Cas）作为植物基因组编辑的有效工具（Li等人，2013; Shan等人已经出版了诸如基因敲除，敲入或转录调控等各种各样的应用，例如，2013; Nekrasov等人，2013）。到目前为止，植物中多种突变体的产生涉及繁琐的杂交或诱变，随后大量人群的耗时筛选，Cas9系统的使用似乎是有希望的方法来克服这些问题。我们设计了一种二元载体，其结合了在拟南芥UBIQUITIN10（UBQ10）启动子和引导RNA（gRNA）控制下的优化的化脓性链球菌（Caspase）密码子的编码序列）由 A驱动的表现盒。拟南芥U6 - 启动子，用于在拟南芥中进行有效的多重编辑（阎等人，2016年）。在这里，我们描述了一个逐步的方案，以经济有效的方式生成含有多个gRNA的二元载体和基于经典克隆方法的Cas9核酸酶。背景 RNA引导的Cas9系统源于针对外源DNA的细菌防御系统（Sorek等人，2013）。由于其高效率，易于处理和多重编辑的可能性，已经被认为是基因组编辑的选择方法。通常，Cas9基因编辑系统涉及单个合成RNA分子，其指导Cas9蛋白质靶向所需DNA位点以进行基因组修饰或转录控制的gRNA。 gRNA-Cas9复合物通过gRNA-DNA配对识别靶向的DNA，并需要存在原始相邻基序（PAM）。 ...
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| A Golden Gate-based Protocol for Assembly of Multiplexed gRNA Expression Arrays for CRISPR/Cas9
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Author:
Date:
2016-12-05
[Abstract] The CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-associated protein 9 (Cas9) has become the most broadly used and powerful tool for genome editing. Many applications of CRISPR-Cas9 require the delivery of multiple small guide RNAs (gRNAs) into the same cell in order to achieve multiplexed gene editing or regulation. Using traditional co-transfection of single gRNA expression vectors, the likelihood of delivering several gRNAs into the same cell decreases in accordance with the number of gRNAs. Thus, we have developed a method to efficiently assemble gRNA expression cassettes (2-30 gRNAs) into one single vector using a Golden-Gate assembly method (Vad-Nielsen et al., 2016). In this protocol, we describe the detailed step-by-step instructions for assembly of ...
[摘要] CRISPR（聚簇定期间隔短回文重复序列）相关蛋白9（Cas9）已成为最广泛使用和强大的基因组编辑工具。 CRISPR-Cas9的许多应用需要将多个小导向RNA（gRNA）递送到相同的细胞中以实现多重基因编辑或调节。使用单个gRNA表达载体的传统共转染，将几个gRNA递送到相同细胞中的可能性根据gRNA的数量减少。因此，我们开发了使用Golden-Gate装配方法（Vad-Nielsen等人，2016）将gRNA表达盒（2-30gRNA）有效地装配到一个单一载体中的方法。在这个协议，我们描述详细的分步指示的多路复用gRNA表达式数组的组装。在我们的表达阵列中使用的gRNA支架是由人U6启动子驱动的来自化脓性链球菌的Cas9蛋白的gRNA 1.0系统。
关键字： CRISPR，SpCas9，金门汇编，多重gRNA阵列，同时遗传操作
[背景] ...
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