| Enzymatic Construction of Protein Polymer/Polyprotein Using OaAEP1 and TEV Protease
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Author:
Date:
2020-04-20
[Abstract] The development of chemical and biological coupling technologies in recent years has made possible of protein polymers engineering. We have developed an enzymatic method for building polyproteins using a protein ligase OaAEP1 (asparagine endopeptidase 1) and protease TEV (tobacco etching virus). Using a mobile TEV protease site compatible with the OaAEP1 ligation, we achieved a stepwise polymerization of the protein on the surface. The produced polyprotein can be verified by protein unfolding scenario using atomic force microscopy-based single-molecule force spectroscopy (AFM-SMFS). Thus, this study provides an alternative method for polyprotein engineering and immobilization.
[摘要] [摘要 ] 发展化学和生物耦合技术，近年来已成为可能中蛋白质聚合物工程。我们已经开发了酶法用于构建多蛋白使用蛋白连接酶OaAEP1（天冬酰胺内肽酶1）和蛋白酶TEV（烟草蚀刻病毒）。使用与OaAEP1连接兼容的移动TEV蛋白酶位点，我们实现了蛋白质在表面上的逐步聚合。产生的多蛋白可以使用基于原子力显微镜的单分子力谱（AFM-SMFS）通过蛋白质展开场景来验证。因此，这项研究为多蛋白工程和固定化提供了另一种方法。
[背景 ] 已经开发了几种基于生化反应的蛋白质聚合方法，例如，一种方法是设计以额外的半胱氨酸为连接基本单位的蛋白质单体（Dietz 等，2006 ; Durner 等，2017）。）。另一种方法是构建完整的基因的人工蛋白质寡聚物（腐肉巴斯克斯等人，1999年 ; Giganti 等人。，2018）。然而，该工程大尺寸高分子蛋白质往往是具挑战性这为了应对这一挑战，我们开发了一种酶介导的方法，可使用蛋白质连接酶和蛋白酶逐步构建蛋白质聚合物/多聚蛋白质（Yang 等人，2017 ; Deng 等人，2019）。 ）在蛋白单元的N端加上一个亮氨酸（L）设计为ENLYFQ / GL-POI（POI：目的蛋白），TEV裂解产生GL-POI的N端GL残基，该残基可兼容进一步的OaAEP1连接。我们的合成方法提供了一种新方法 ...
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| Expression, Purification and Crystallization of Recombinant Arabidopsis Monogalactosyldiacylglycerol Synthase (MGD1)
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Author:
Date:
2016-12-20
[Abstract] In plant cells, galactolipids are predominant, representing up to 50% of the lipid content in photosynthetic tissues. Galactolipid synthesis is initiated by MGDG synthases (MGDs), which use UDP-galactose as a donor sugar and diacylglycerol (DAG) as acceptor, to form monogalactosyldiacylglycerol (MGDG). This protocol is used to produce a recombinant form of Arabidopsis thaliana (A. thaliana) monogalactosyldiacylglycerol synthase 1 (MGD1) protein, in Escherichia coli (E. coli), using a two-step chromatographic purification procedure. The protein is easily expressed and purified to milligram quantities, suitable for biochemical and structural studies. The crystallization of MGD1 is also described.
[摘要] 在植物细胞中，半乳糖脂是主要的，代表高达光合组织脂质含量的50％。通过使用UDP-半乳糖作为供体糖和二酰基甘油（DAG）作为受体的MGDG合成酶（MGD）启动半乳糖脂合成以形成单糖基二酰基甘油（MGDG）。该方案用于在大肠杆菌中产生拟南芥（Arabidopsis thaliana）（拟南芥）单糖半乳糖二酰基甘油合酶1（MGD1）蛋白的重组形式（大肠杆菌），使用两步色谱纯化方法。蛋白质容易表达和纯化至数量，适用于生物化学和结构研究。还描述了MGD1的结晶。
背景 以前在e中表达植物MGD的尝试。大肠杆菌显示约99％的重组蛋白质积累在包涵体中（Miège等，1999）。开发了使用洗涤剂或体外包涵体折叠方案的细菌膜的溶解，并产生足够的纯和活性级分，足以监测酶的活性，但不进行其结构研究（Nishiyama et ...
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| Heterologous Expression and Purification of Catalytic Domain of CESA1 from Arabidopsis thaliana
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Author:
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2016-10-20
[Abstract] Heterologous expression of plant cellulose synthase (CESA) and its purification has remained a challenge for decades impeding detailed biophysical, biochemical and structural characterization of this key enzyme. An in-depth knowledge of structure and function of CESA proteins would enable us to better understand the hierarchical structure of the plant cell wall. Here, we report a detailed, and reproducible method of purification of catalytic domain of CESA1 from Arabidopsis thaliana that was recombinantly expressed in Escherichia coli. The method relies on a two stage purification procedure to obtain the catalytic domain in monomer and trimer forms. The biochemical and biophysical data including low resolution structures of the protein have been published (Vandavasi et ...
[摘要] 植物纤维素合酶（CESA）的异源表达及其纯化在数十年来一直是阻碍该关键酶的详细生物物理，生物化学和结构表征的挑战。对CESA蛋白的结构和功能的深入了解将使我们能够更好地理解植物细胞壁的层次结构。在这里，我们报告了在大肠杆菌中重组表达的来自拟南芥的CESA1的催化结构域的详细的和可重复的纯化方法。该方法依赖于两阶段纯化方法以获得单体和三聚体形式的催化结构域。已经公开了包括蛋白质的低分辨率结构的生物化学和生物物理数据（Vandavasi等人，2016）。目前，这种蛋白质的结晶研究正在进行中。
[Backg 圆形] 纤维素是植物细胞壁最重要的结构组分，地球最大的生物可再生材料来源，但它的植物合成机制了解很少。植物纤维素合成复合物（CSC），也称为"玫瑰花结"，因为其在电子显微镜图像中的六聚体外观，是一个大的多亚基跨膜蛋白复合物负责纤维素链的合成和它们组装成微原纤维。 ...
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