| Analyses of Root-secreted Acid Phosphatase Activity in Arabidopsis
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] Induction and secretion of acid phosphatase (APase) is a universal adaptive response of higher plants to low-phosphate stress (Tran et al., 2010). The intracellular APases are likely involved in the remobilization and recycling of phosphate (Pi) from intracellular Pi reserves, whereas the extracellular or secreted APases are believed to release Pi from organophosphate compounds in the rhizosphere. The phosphate starvation-induced secreted APases can be released into the rhizosphere or retained on root surfaces (root-associated APases). In this article, we describe the protocols for analyzing root-secreted APase activity in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis). In Arabidopsis, the activity of both root-associated APases and APases that are ...
[摘要] 酸性磷酸酶（APase）的诱导和分泌是高等植物对低磷酸盐胁迫的普遍适应性反应（Tran et al。，2010）。细胞内APase可能参与磷酸盐（Pi）从细胞内Pi储备的再利用和再循环，而细胞外或分泌的APase被认为从根际中的有机磷酸盐化合物中释放出Pi。磷酸盐饥饿诱导的分泌的APase可以释放到根际中或保留在根表面（根相关的APase）上。在本文中，我们描述了在拟南芥（Arabidopsis thaliana）（拟南芥）中分析根分泌的APase活性的方案。在拟南芥中，释放到根际的根系相关APase和APase的活性可以基于它们切割合成底物，释放黄色产物的对硝基苯基磷酸（pNPP）的能力来定量，对硝基苯酚（pNP）（Wang等，2011和2104）。根系相关的APase活性也可以通过将显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基 - 磷酸酯（BCIP）施用到根表面来直接显现（Lloyd等人，2001; Tomscha et al。 ，2004; Wang等人，2011和2014），而释放到根际中的APase的同功酶可以使用凝胶内测定法（Trull和Deikman，1998; Tomscha等人，2004; Wang等人， 2011年和2014年）。之前已经描述了用于分析拟南芥细胞内APase活性的方案（Vicki和William，2013）。
【背景】磷酸盐（Pi）是植物通过根系发生磷的主要形式，大多数土壤中的Pi水平较低，导致Pi饿。为了应对这种营养压力，植物引发了一系列适应性反应，增加了其生存和增长。 ...
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| Tandem Purification of His6-3x FLAG Tagged Proteins for Mass Spectrometry from Arabidopsis
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Author:
Date:
2016-12-05
[Abstract] Tandem affinity purification is a powerful method to identify protein complexes that function in association with a known gene of interest. This protocol describes a methodology to capture proteins tagged with His6-3x FLAG explicitly for the purpose of on-bead digestion and identification by mass spectrometry. The high sensitivity and specificity of our methods allow for purification of proteins expressed at native levels from endogenous promoters to enable uncovering the functional roles of plant protein complexes.
[摘要] 串联亲和纯化是识别与已知感兴趣基因相关联的蛋白质复合物的有力方法。 该方案描述了一种用于捕获用His6-3x FLAG标记的蛋白质的方法，用于通过质谱法进行珠粒消化和鉴定。 我们的方法的高灵敏度和特异性允许从内源启动子纯化以天然水平表达的蛋白质，以揭示植物蛋白复合物的功能作用。
【背景】蛋白质复合物作为信号平台，分子机器和构建细胞生命的支架。鉴定蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）或蛋白质复合物的组成对于提供对基因生物化学功能的了解是非常重要的。因此，需要了解发现PPI的简便方法，以了解基因型如何决定植物中的表型。
通常使用的蛋白质纯化方法包括色谱法，例如大小排阻色谱法（也称为凝胶过滤），离子交换层析和亲和层析。通常需要组合几种不同的色谱方法以达到足够的纯度以鉴定相关的复合物。最近，亲和纯化与质谱联用（AP-MS）已经成为系统地鉴定体内蛋白质 - ...
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