| Reverse Phase-high-performance Liquid Chromatography (RP-HPLC) Analysis of Globin Chains from Human Erythroid Cells
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Author:
Date:
2021-01-20
[Abstract] β-hemoglobinopathies are severe genetic disorders characterized either by the abnormal synthesis of the adult β-globin chains of the hemoglobin (Hb) tetramer (βS-globin chains) in sickle cell disease (SCD) or by the reduced β-globin production in β-thalassemia. The identification and quantification of globin chains are crucial for the diagnosis of these diseases and for testing new therapeutic approaches aimed at correcting the β-hemoglobinopathy phenotype. Conventional techniques to detect the different Hb molecules include cellulose-acetate electrophoresis (CEA), capillary electrophoresis (CE), isoelectric focusing (IEF), and cation-exchange-HPLC (CE-HPLC). However, these methods cannot distinguish the different globin chains and precisely determine their ...
[摘要] [摘要] β-血红蛋白病是严重的遗传性疾病，其特征在于或者由血红蛋白的β成人珠蛋白链的合成异常血红蛋白（Hb）四聚体（β小号球蛋白链）的镰状细胞病（SCD）或通过减少β- β地中海贫血中球蛋白的产生。珠蛋白链的鉴定和定量对于这些疾病的诊断和测试旨在纠正β-血红蛋白病表型的新治疗方法至关重要。检测不同Hb分子的常规技术包括醋酸纤维素电泳（CEA）， 毛细管电泳（CE），等电聚焦（IEF）和阳离子交换HPLC（CE-HPLC）。但是，这些方法无法区分不同的球蛋白链，无法精确确定它们的相对表达。我们已经建立了高分辨率和可再现的反相HPLC（RP-HPLC），以基于其不同的疏水特性来检测和鉴定组成血红蛋白四聚体的球蛋白链。RP-HPLC流动相由产生疏水环境的乙腈（ACN）和三氟乙酸（TFA）组成，后者破坏Hb四聚体中的血红素基团并释放出单独的球蛋白链。将含Hb的裂解物上样到Aeris TM 3.6 µm WIDEPORE C4 200ÅLC色谱柱上，随着时间的流逝疏水性梯度的增加，可以进行珠蛋白链分离。球蛋白链的相对量在220nm的波长（λ）下测量。该协议被设计用于（i）从人外周血获得的红血细胞（红细胞），（II）评价红细胞珠蛋白链在体外从造血干细胞分化的/祖细胞（HSPC的），和（iii）脉冲串形成单位- è ...
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| Estimation of the Minimum Number of Replication Origins Per Chromosome in any Organism
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Author:
Date:
2020-10-20
[Abstract] Eukaryote nuclear genomes predominantly replicate through multiple replication origins. The number of replication origins activated per chromosome during the S-phase duration may vary according to many factors, but the predominant one is replication stress. Several studies have applied different approaches to estimate the number and map the positions of the replication origins in various organisms. However, without a parameter to restrict the minimum of necessary origins, less sensitive techniques may suggest conflicting results. The estimation of the minimum number of replication origins (MO) per chromosome is an innovative method that allows the establishment of a threshold, which serves as a parameter for genomic approaches that map origins. For this, the MO can be easily ...
[摘要] [摘要] 比率可能因多种因素而变化，但最主要的因素是复制应力。一些研究应用了不同的方法来估计复制源在不同生物体中的数量和位置。然而，如果没有一个参数来限制必要起源的最小值，那么不太敏感的技术可能会产生相互矛盾的结果。估计每个染色体的最小复制源数量（MO）是一种创新的方法，它允许建立一个阈值，作为绘制起源的基因组方法的参数。为此，MO可以很容易地通过一个公式得到，这个公式需要作为参数：染色体大小、S期持续时间和复制率。在基因组数据库（如NCBI）中可以获得任何生物体的染色体大小，通过监测DNA复制来估计S期的持续时间，并通过DNA组合方法获得复制率。 提供了一种简单、快速的估算MO的方法一个新的方法学框架来协助研究任何有机体。
关键词： DNA复制，复制来源，复制率，S期持续时间，染色体大小
[背景] ...
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| Superresolution Microscopy of Drosophila Indirect Flight Muscle Sarcomeres
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Author:
Date:
2020-06-20
[Abstract] Sarcomeres are extremely highly ordered macromolecular assemblies where proper structural organization is an absolute prerequisite to the functionality of these contractile units. Despite the wealth of information collected, the exact spatial arrangement of many of the H-zone and Z-disk proteins remained unknown. Recently, we developed a powerful nanoscopic approach to localize the sarcomeric protein components with a resolution well below the diffraction limit. The ease of sample preparation and the near crystalline structure of the Drosophila flight muscle sarcomeres make them ideally suitable for single molecule localization microscopy and structure averaging. Our approach allowed us to determine the position of dozens of H-zone and Z-disk proteins with a quasi-molecular, ...
[摘要] [摘要] 肉瘤是高度有序的大分子组装体，其中适当的结构组织是这些可收缩单位功能的绝对前提。尽管收集到大量信息，但许多H区和Z盘蛋白的确切空间排列最近未知的是，我们开发了一种强大的纳米方法来定位肌氨酸蛋白成分，其分辨率远低于衍射极限。样品制备的简便性和果蝇的近晶体结构 飞行肌肉瘤使其非常适合单分子定位显微镜检查和结构平均。我们的方法使我们能够以大约5-10 nm的准分子定位精度确定数十个H区和Z盘蛋白的位置。下文所述的协议为制备用于dSTORM成像的单个肌原纤维提供了一种简便且可重现的方法，此外还包括对定制的免费提供的软件工具箱的深入描述，以处理和定量分析原始定位数据。
[背景 ] 肉瘤的结构已通过X射线晶体学以及各种EM方法进行了详细研究，从而形成了来自许多物种的细丝和粗丝的准原子模型。尽管如此，这些检查取得了很好的结果对于肌动蛋白-肌球蛋白重叠区的了解，I带和H区复合物的空间排列仍是未知之数。荧光超分辨率显微镜（也称为纳米显微镜）的最新进展提供了远低于衍射极限的空间分辨率。值得注意的是，单分子定位显微镜（SMLM）可以非常高精度地提供多蛋白复合物的定位图，实际上达到了单个蛋白的大小分辨率（Sigal et al。，2018）。
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