| Active Cdk5 Immunoprecipitation and Kinase Assay
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Author:
Date:
2017-07-05
[Abstract] Cdk5 activity is regulated by the amounts of two activator proteins, p35 and p39 (Tsai et al., 1994; Zheng et al., 1998; Humbert et al., 2000). The p35-Cdk5 and p39-Cdk5 complexes have differing sensitivity to salt and detergent concentrations (Hisanaga and Saito, 2003; Sato et al., 2007; Yamada et al., 2007; Asada et al., 2008). Cdk5 activation can be directly measured by immunoprecipitation of Cdk5 with its bound activator, followed by a Cdk5 kinase assay. In this protocol, buffers for cell lysis and immunoprecipitation are intended to preserve both p35- and p39-Cdk5 complexes to assess total Cdk5 activity. Cells are lysed and protein concentration is determined in the post-nuclear supernatant. Cdk5 is immunoprecipitated from equal ...
[摘要] Cdk5活性受两种激活蛋白p35和p39（Tsai et al。，1994; Zheng et al。，1998; Humbert等人）的量的调节，2000）。 p35-Cdk5和p39-Cdk5复合物对盐和洗涤剂浓度的敏感性不同（Hisanaga和Saito，2003; Sato et al。，2007; Yamada等人， 2007; Asada 等人，2008）。 Cdk5激活可以通过Cdk5与其结合的激活剂的免疫沉淀直接测量，随后进行Cdk5激酶测定。在该方案中，用于细胞裂解和免疫沉淀的缓冲液旨在保持p35-和p39-Cdk5复合物以评估总Cdk5活性。裂解细胞，并在核后上清液中测定蛋白浓度。 Cdk5在实验组之间从等量的总蛋白免疫沉淀。然后进行洗涤以除去外来蛋白质并平衡激酶缓冲液中的Cdk5-活化剂复合物。然后将Cdk5与组蛋白H1孵育，组蛋白H1是Cdk5和[γ- 32 P] ATP在体外成功建立的靶标。反应通过SDS-PAGE解析并转移到膜上，用于可视化H1磷酸化和免疫沉淀的Cdk5水平的免疫印迹。我们已经使用该测定来建立p39作为少突神经胶质谱系中Cdk5的主要活化剂。然而，该测定法适用于对裂解条件进行适当调整的其它细胞谱系或组织。
【背景】虽然Cdk5通常与神经元功能相关，但最近的工作已经证明Cdk5也可以调节少突胶质细胞祖细胞（OPC）的发育（Tang等人，1998; ...
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| Measuring Procaspase-8 and -10 Processing upon Apoptosis Induction
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Author:
Date:
2017-01-05
[Abstract] Apoptosis or programmed cell death is important for multicellular organisms to keep cell homeostasis and for the clearance of mutated or infected cells. Apoptosis can be induced by intrinsic or extrinsic stimuli. The first event in extrinsic apoptosis is the formation of the Death-Inducing Signalling Complex (DISC), where the initiator caspases-8 and -10 are fully activated by several proteolytic cleavage steps and induce the caspase cascade leading to apoptotic cell death. Analysing the processing of procaspases-8 and -10 by Western blot is a commonly used method to study the induction of apoptosis by death receptor stimulation. To analyse procaspase-8 and -10 cleavage, cells are stimulated with a death ligand for different time intervals, lysed and subjected to Western blot analysis ...
[摘要] 细胞凋亡或程序性细胞死亡对于多细胞生物保持细胞稳态和清除突变或感染细胞是重要的。 细胞凋亡可以由内在或外在的刺激诱导。 外源性凋亡中的第一个事件是死亡诱导信号复合物（DISC）的形成，其中引发剂半胱天冬酶-8和-10通过若干蛋白水解切割步骤完全活化并诱导胱天蛋白酶级联导致凋亡细胞死亡。 通过蛋白质印迹分析procaspases-8和-10的处理是通过死亡受体刺激研究凋亡诱导的常用方法。 为了分析procaspase-8和-10切割，用死亡配体刺激细胞不同的时间间隔，裂解，并使用抗半胱天冬酶-8和抗半胱天冬酶-10抗体进行蛋白质印迹分析。 这可以监测胱天蛋白酶切割产物，从而诱导细胞凋亡。
背景 胱天蛋白酶是作为无活性酶原产生并被蛋白水解切割活化的蛋白酶（Degterev等人，2003）。胱天蛋白酶级联的激活是凋亡细胞死亡期间最重要的事件，其诱导凋亡细胞的典型生化和形态学变化。与非活性执行者procaspases相反，启动子胱天蛋白酶8/9/10具有限制性蛋白水解活性，并在高分子量复合物中完全活化（Lavrik等人，2005）。促凋亡受体TNF-R1（肿瘤坏死因子受体1），CD95 / ...
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| Affinity Pulldown of Biotinylated RNA for Detection of Protein-RNA Complexes
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Author:
Date:
2016-12-20
[Abstract] RNA-binding proteins (RBPs) have recently emerged as crucial players in the regulation of gene expression. The interactions of RBPs with target mRNAs control the levels of gene products by altering different regulatory steps, including pre-mRNA splicing and maturation, nuclear mRNA export, and mRNA stability and translation (Glisovic et al., 2008). There are several methodologies available today to identify RNAs bound to specific RBPs; some detect only recombinant molecules in vitro, others detect recombinant and endogenous molecules, while others detect only endogenous molecules. Examples include systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX), biotinylated RNA pulldown assay, RNA immunoprecipitation (RIP) assay, electrophoretic mobility shift assay ...
[摘要] RNA结合蛋白（RBP）近来已经成为调控基因表达的关键因素。 RBP与靶mRNA的相互作用通过改变不同的调节步骤来控制基因产物的水平，包括mRNA前体剪接和成熟，核mRNA输出和mRNA稳定性和翻译（Glisovic et al。，2008） ）。目前有几种方法可用于鉴定与特定RBP结合的RNA;一些仅在体外检测重组分子，其他检测重组和内源性分子，而其他检测仅内源性分子。实例包括通过指数富集（SELEX），生物素化RNA下拉测定，RNA免疫沉淀（RIP）测定，电泳迁移率变动测定（EMSA），RNA足迹分析和各种UV交联和免疫沉淀（CLIP）方法如CLIP ，PAR-CLIP和iCLIP（Popova等人，2015）。在这里，我们描述了一种简单而有信息的方法来研究和鉴定RBP与其目标转录物之间相互作用的RNA区域（Panda等人，2014和2016）。其重现性和易用性使得该方案成为识别RBP与特异性RNA之间相互作用的快速有效的方法。
背景 RNA蛋白相互作用严重影响基因表达模式。这些核糖核蛋白（RNP）复合物的鉴定对于理解由RNA结合蛋白（RBP）控制的调控机制是必不可少的。最近，广泛的努力导致了开发用于系统分析RNA-蛋白质相互作用的方法。识别RNP复合物的高度信息化方法包括许多不同类型的RNP免疫沉淀（IP）分析。 ...
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