| Oral Microbiome Characterization in Murine Models
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Author:
Date:
2017-12-20
[Abstract] The oral microbiome has been implicated as a trigger for immune responsiveness in the oral cavity, particularly in the setting of the inflammatory disease periodontitis. The protocol presented here is aimed at characterizing the oral microbiome in murine models at steady state and during perturbations of immunity or physiology. Herein, we describe murine oral microbiome sampling procedures, processing of low biomass samples and subsequent microbiome characterization based on 16S rRNA gene sequencing.
[摘要] 口腔微生物组被认为是口腔免疫应答的触发因素，特别是在炎性疾病牙周炎的形成中。 这里提出的协议旨在描述在稳定状态和扰动免疫或生理学的小鼠模型中的口腔微生物群。 在此，我们描述了鼠类口腔微生物群落取样程序，低生物量样品的处理和随后的基于16S rRNA基因测序的微生物群鉴定。
【背景】微生物组在调节组织特异性免疫应答（特别是在屏障部位）中起关键作用（Belkaid和Harrison，2017）。在这些屏障环境中，例如胃肠道和皮肤，选择的共生物显示能够驱动特定免疫细胞群体的发育（Ivanov等人，2009; Naik等人。，2012）。我们的工作最近开始探索口腔微生物组在剪裁组织免疫力方面的影响，尤其是在牙龈处，一个脆弱的口腔屏障部位（Abusleme和Moutsopoulos，2016; Dutzan等人，2017）。
在人类中，众所周知口腔中含有丰富多样的微生物（Human Microbiome Project，2012）。口腔微生物群落的改变与常见的口腔疾病，牙周炎（一种影响牙龈组织并导致组织损伤的炎症）有关（Griffen等人，2012; Abusleme等人。，2013; Moutsopoulos et al 。，2015）。迄今为止，动物模型已经有助于解决微生物组在各种生理和病理条件中的作用（Turnbaugh等人，2006; ...
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| Assaying the Effects of Splice Site Variants by Exon Trapping in a Mammalian Cell Line
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Author:
Date:
2017-05-20
[Abstract] There are several in silico programs that endeavor to predict the functional impact of an individual’s sequence variation at splice donor/acceptor sites, but experimental confirmation is problematic without a source of RNA from the individual that carries the variant. With the aid of an exon trapping vector, such as pSPL3, an investigator can test whether a splice site sequence change leads to altered RNA splicing, through expression of reference and variant mini-genes in mammalian cells and analysis of the resultant RNA products.
[摘要] 有几个计算机程序尝试预测个体在剪接供体/受体位点的序列变异的功能影响，但实验确认是有问题的，没有携带变体的个体的RNA来源。借助于外显子捕获载体，例如pSPL3，研究人员可以通过在哺乳动物细胞中表达参考和变体小基因来测试剪接位点序列变化是否导致改变的RNA剪接，并分析所得RNA产物。
背景 我们希望通过实验测试在TEK基因中鉴定的两个剪接供体位点变体c.760 + 2T> C和c.3300 + 2delT的功能影响（Souma等人，2016）。通常情况下，携带这些序列变体的个体不能获得细胞或mRNA的样品，因此我们利用外显子捕获方法作为功能测试。来自患者的DNA样品可用于感兴趣的基因组区域的PCR扩增。如果患者gDNA样品不可用，也可以通过诸如基于PCR的定点诱变等方法将序列变体并入野生型序列。
＆NBSP;外显子捕获方法最初是为了鉴定长期基因组DNA中的未知外显子而开发的（Duyk等人，1990）。创建了pSPL3外显子捕获载体以提高外显子鉴定的效率和可靠性，并且还允许筛选更大的基因组片段（Church et al。，1994; Nisson等，1994）。 pSPL3载体含有由SV40启动子组成的小型人造基因，具有功能性剪接供体和受体位点的外显子 - 内含子 - ...
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| A Golden Gate-based Protocol for Assembly of Multiplexed gRNA Expression Arrays for CRISPR/Cas9
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Author:
Date:
2016-12-05
[Abstract] The CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-associated protein 9 (Cas9) has become the most broadly used and powerful tool for genome editing. Many applications of CRISPR-Cas9 require the delivery of multiple small guide RNAs (gRNAs) into the same cell in order to achieve multiplexed gene editing or regulation. Using traditional co-transfection of single gRNA expression vectors, the likelihood of delivering several gRNAs into the same cell decreases in accordance with the number of gRNAs. Thus, we have developed a method to efficiently assemble gRNA expression cassettes (2-30 gRNAs) into one single vector using a Golden-Gate assembly method (Vad-Nielsen et al., 2016). In this protocol, we describe the detailed step-by-step instructions for assembly of ...
[摘要] CRISPR（聚簇定期间隔短回文重复序列）相关蛋白9（Cas9）已成为最广泛使用和强大的基因组编辑工具。 CRISPR-Cas9的许多应用需要将多个小导向RNA（gRNA）递送到相同的细胞中以实现多重基因编辑或调节。使用单个gRNA表达载体的传统共转染，将几个gRNA递送到相同细胞中的可能性根据gRNA的数量减少。因此，我们开发了使用Golden-Gate装配方法（Vad-Nielsen等人，2016）将gRNA表达盒（2-30gRNA）有效地装配到一个单一载体中的方法。在这个协议，我们描述详细的分步指示的多路复用gRNA表达式数组的组装。在我们的表达阵列中使用的gRNA支架是由人U6启动子驱动的来自化脓性链球菌的Cas9蛋白的gRNA 1.0系统。
关键字： CRISPR，SpCas9，金门汇编，多重gRNA阵列，同时遗传操作
[背景] ...
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