| Biochemical Analysis of Dimethyl Suberimidate-crosslinked Yeast Nucleosomes
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] Nucleosomes are the fundamental unit of eukaryotic chromosome packaging, comprised of 147 bp of DNA wrapped around two molecules of each of the core histone proteins H2A, H2B, H3, and H4. Nucleosomes are symmetrical, with one axis of symmetry centered on the homodimeric interaction between the C-termini of the H3 molecules. To explore the functional consequences of nucleosome symmetry, we designed an obligate pair of H3 heterodimers, termed H3X and H3Y, allowing us to compare cells with single or double H3 alterations. Our biochemical validation of the heterodimeric X-Y interaction included intra-nucleosomal H3 crosslinking using dimethyl suberimidate (DMS). Here, we provide a detailed protocol for the use of DMS to analyze yeast nucleosomes.
[摘要] 核小体是真核染色体包装的基本单元，由围绕核心组蛋白H2A，H2B，H3和H4中的每一个的两个分子包裹的147bp DNA组成。 核小体是对称的，一个对称轴以H3分子的C-末端之间的同源二聚体相互作用为中心。 为了探索核小体对称性的功能性后果，我们设计了一对特异性H3异二聚体，称为H3X和H3Y，使我们能够比较具有单一或双重H3改变的细胞。 我们对异二聚体X-Y相互作用的生物化学验证包括使用二甲基琥珀三酸酯（DMS）进行的核内H3交联。 在这里，我们提供了使用DMS来分析酵母核小体的详细方案。
【背景】组蛋白的翻译后修饰影响染色体生物学的各个方面，包括转录，复制，修复和重组。因为核小体包含每个核心组蛋白的两个拷贝，所以修饰可以是对称的（在两个H3尾部上的相同修饰，例如，在核小体内的两个H3尾部上的K27me（Voigt等人
对于单个核小体内H3X-H3Y相互作用的生化验证，我们生成了表达细菌生物素连接酶BirA，N-末端V5-标记的H3X和N-末端生物素接受表位标记的H3Y的酵母菌株（Beckett等人， 1999）。 ...
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| PEA-CLARITY: Three Dimensional (3D) Molecular Imaging of Whole Plant Organs
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Author:
Date:
2016-11-05
[Abstract] Here we report the adaptation of the CLARITY technique to plant tissues with addition of enzymatic degradation to improve optical clearing and facilitate antibody probe penetration. Plant-Enzyme-Assisted (PEA)-CLARITY, has allowed deep optical visualisation of stains, expressed fluorescent proteins and IgG-antibodies in tobacco and Arabidopsis leaves. Enzyme treatment enabled penetration of antibodies into whole tissues without the need for any sectioning of the material. Therefore, this protocol facilitates protein localisation of intact tissue in 3D whilst retaining cellular structure.
[摘要] 在这里我们报告CLARITY技术适应植物组织与添加的酶降解，以提高光学清除和促进抗体探针穿透。植物 - 酶辅助（PEA）-CLARITY，允许在烟草和拟南芥叶中的污渍，表达的荧光蛋白和IgG抗体的深度光学可视化。酶处理使得抗体能够穿透进入整个组织，而不需要材料的任何切片。因此，该方案促进3D中完整组织的蛋白定位，同时保留细胞结构。
[背景] 使用组织学染色等技术固定和包埋植物组织进行分子探查，免疫组织化学或原位杂交几十年来一直是细胞生物学研究的基础。将这些技术应用于3D组织分析严重受限于需要切片组织，对每个部分成像，然后将图像重新组装成感兴趣结构的3D表示。这里我们提出从二维平面到三维的基本转变，同时保留感兴趣的分子结构，而不需要切片植物组织。固定和"清除"技术，如SeeDB，ScaleA2，3DISCO，CLARITY和其最近的变种PACT的最新进展使小鼠和大鼠模型中完整成像的整个胚胎，大脑和其他器官。新的CLARITY系统固定并结合丙烯酰胺网状结构内的组织。蛋白质和核酸通过甲醛与丙烯酰胺网状物共价连接，然后使用洗涤剂（SDS）除去动物细胞膜的光学干扰脂质结构。这使得这样的组织是光学透明的，并且适合于使用共聚焦显微镜的高达〜5mm的深度成像
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