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Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] This protocol describes how to measure protein-protein interactions by microscale thermophoresis (MST) using the MonolithTM NT.115 instrument (NanoTemper). We have used the protocol to determine the binding affinities between three different flavodoxin reductases (FNRs) and a flavodoxin-like protein, NrdI, from Bacillus cereus (Lofstad et al., 2016). NrdI is essential in the activation of the manganese-bound form of the class Ib ribonucleotide reductase (RNR) system. RNRs, in turn, are the only source of the de novo synthesis of deoxyribonucleotides required for DNA replication and repair in all living organisms.
[摘要] 该协议描述了如何使用Monolith TM NT.115仪器（NanoTemper）通过微量热泳法（MST）测量蛋白质 - 蛋白质相互作用。我们已经使用方案来确定三种不同的黄素氧还蛋白还原酶（FNR）和来自蜡样芽孢杆菌（Lofstad等）的黄素氧还蛋白样蛋白NrdI之间的结合亲和力， 2016）。 NrdI对于Ib类核糖核苷酸还原酶（RNR）系统的锰结合形式的活化至关重要。反过来，RNRs是所有生物体中DNA复制和修复所需的脱氧核糖核苷酸合成的唯一来源。
蛋白质 - 蛋白质的相互作用通常以相关的解离常数（K D ）为特征。可以使用诸如等温量热法（ITC），NMR光谱和表面等离子体共振（SPR）的各种技术来建立结合常数。另一种方法是基于热泳法，其中不同分子（例如蛋白质 - 蛋白质复合物与单个蛋白质）对温度梯度的反应不同（Duhr和Braun，2006; Seidel等人， 2013）。该方法快速，不需要样品固定，样品要求较低。简言之，其中一种蛋白质用荧光染料标记并保持在恒定的低浓度。建立稀释系列，其他蛋白质稀释至16倍，产生广泛的浓度范围。随后将两种蛋白质混合并加载到毛细管中，毛细管在Monolith TM ...
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Author:
Date:
2016-12-20
[Abstract] Activity-based probes (ABP) are small organic molecules that irreversibly bind to the active center of a specific enzyme family and may be coupled to a fluorophore or an affinity tag (Li et al., 2013). Here, we describe a method to pull-down active catalytic standard and immunoproteasome subunits in cell lysates using the biotinylated, proteasome-specific ABP Biotin-Epoxomicin (Bio-EP). Covalent labeling of the active catalytic subunits with Bio-EP is followed by a pull-down using streptavidin-coated beads. After elution from the beads, enriched subunits may be detected via Western blot, tandem mass spectrometry (Li et al., 2013), or alternative techniques.
[摘要] 基于活性的探针（ABP）是不可逆地结合特定酶家族的活性中心并且可以偶联至荧光团或亲和标签的小有机分子（Li等人，2013）。在这里，我们描述了使用生物素化的蛋白酶体特异性ABP生物素 - 环氧丙素（Bio-EP）在细胞裂解物中下拉活性催化标准和免疫蛋白酶体亚基的方法。用Bio-EP共价标记活性催化亚单位，然后使用链霉抗生物素蛋白包被的珠子进行下拉。从珠中洗脱后，可以通过Western印迹，串联质谱法（Li et al。，2013）或其他技术检测富集的亚单位。
背景 蛋白酶体是存在于真核细胞的细胞核和细胞质中的桶形多分子酶复合物。蛋白质降解是重要的，包括加工MHC I呈递的抗原肽，并调节许多细胞过程（Kammerl和Meiners，2016）。在造血起源的细胞中，标准（组成型）蛋白酶体通常被免疫蛋白酶体（Meiners等人，2014）所替代，其在三种不同的催化活性β-亚基的掺入中不同（图1）。
为了研究单个催化亚基的分子功能并调节生理过程，亚基特异性蛋白酶体抑制剂的发展是必不可少的。 de ...
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