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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] The programmable Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-associated nuclease 9 (Cas9) technology revolutionized genome editing by providing an efficient way to cut the genome at a desired location (Ledford, 2015). In mammalian cells, DNA lesions trigger the error-prone non-homologous end joining (NHEJ) DNA repair mechanism. However, in presence of a DNA repair template, Homology-Directed Repair (HDR) can occur leading to precise repair of the lesion site. This last process can be exploited to enable precise knock-in changes by introducing the desired genomic alteration on the repair template. In this protocol we describe the delivery of long repair templates (> 200 nucleotides) using recombinant Adeno Associated Virus (rAAV) for CRISPR-Cas9-based knock-in of a ...
[摘要] 可编程集群定期间隔短回归度（CRISPR）相关核酸酶9（Cas9）技术通过提供在所需位置切割基因组的有效方式，彻底改变了基因组编辑（Ledford，2015）。 在哺乳动物细胞中，DNA损伤触发易发生非同源末端连接（NHEJ）DNA修复机制。 然而，在DNA修复模板的存在下，可以发生同源性定向修复（HDR），导致病变部位的精确修复。 可以利用最后的方法，通过在修复模板上引入所需的基因组改变来实现精确的敲入变化。 在本协议中，我们描述了使用重组腺相关病毒（rAAV）在人细胞系中进行基于CRISPR-Cas9的C-末端标签序列敲入的长修复模板（> 200个核苷酸）的递送。
尽管有关CRISPR-Cas9产生的敲门模型系统的大量报告，敲门砖报告仍然落后。由于许多应用，产生敲入细胞系仍然是基因组编辑的明显目标。敲入改变的引入通常依赖于修复模板DNA的存在，并且在位点特异性双链（ds）DNA断裂被引入接近改变位点的基因组中后，HDR修复机制的激活。不同的模板可以传送到修复机器，范围从含有广泛同源区域和可选选择盒的经典线性化载体到约200个核苷酸的单链（ss）DNA寡核苷酸（Chen等人， ...
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Date:
2016-12-20
[Abstract] Adeno-associated virus (AAV)-based targeting vectors have 1-4-log higher gene targeting efficiencies compared with plasmid-based targeting vectors. The efficiency of AAV-mediated gene targeting is further increased by introducing a promoter-trap system into targeting vectors. In addition, we found that the use of ribosome-skipping 2A peptide rather than commonly used internal ribosome entry site (IRES) in the promoter-trap system results in significantly higher AAV-mediated gene targeting efficiencies (Karnan et al., 2016). In this protocol, we describe the procedures for AAV-mediated gene targeting exploiting 2A for promoter trapping, including the construction of a targeting vector based on the platform plasmid pAAV-2Aneo or pAAV-2Aneo v2, production of AAV particles, infection ...
[摘要] 与基于质粒的靶向载体相比，基于腺相关病毒（AAV）的靶向载体具有1-4对较高的基因靶向效率。 通过将启动子捕获系统引入靶向载体中，AAV介导的基因靶向的效率进一步增加。 此外，我们发现使用核糖体跳跃2A肽而不是通常使用的内部核糖体进入位点（IRES）在启动子捕获系统中导致显着更高的AAV介导的基因靶向效率（Karnan等，2016）。 在该方案中，我们描述了AAV介导的基因靶向开发2A用于启动子捕获的程序，包括基于平台质粒pAAV-2Aneo或pAAV-2Aneo v2的靶向载体的构建，AAV颗粒的产生，细胞感染 基于AAV的靶向载体，以及基因靶向细胞克隆的分离和验证。
【背景】以前在其他方案中描述了AAV介导的基因靶向的程序（对应于本方案的BG部分）（Kohli等人，2004; Rago等人，2007; Khan等人，2011; Howes and Schofield ，2015）。 然而，该方案提供了如何使用基于2A的启动子捕获系统首次进行AAV介导的基因靶向的详细描述。
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