| Conjugation Protocol Optimised for Roseburia inulinivorans and Eubacterium rectale
|
|
Author:
Date:
2020-04-05
[Abstract] Roseburia and Eubacterium species of the human gut microbiota play an important role in the maintaince of human health, partly by producing butyrate, the main energy source of our colonic epithelial cells. However, our knowledge of the biochemistry and physiology of these bacteria has been limited by a lack of genetic manipulation techniques. Conjugative transposons previously introduced into Roseburia species could not be easily modified, greatly limiting their applicability as genetic modification platforms. Modular plasmid shuttle vectors have previously been developed for Clostridium species, which share a taxonomic order with Roseburia and Eubacterium, raising the possibility that these vectors could be used in these organisms. ...
[摘要] [摘要 ] 人体肠道菌群中的玫瑰菌属和真细菌属在维持人类健康中起着重要作用，部分原因是产生丁酸盐，这是我们结肠上皮细胞的主要能源。但是，由于缺乏基因操作技术，我们对这些细菌的生物化学和生理学的认识受到限制。先前引入玫瑰花属物种的共轭转座子不容易被修饰，极大地限制了它们作为基因修饰平台的适用性。MOD ular质粒穿梭载体先前已经开发了用于梭菌物种，其与共享一个分类次序ř oseburia 和真杆菌，提高这些矢量可以在这些生物体中使用的可能性。在这里，我们描述了一种优化缀合协议使得能够自主复制的质粒的从转印大肠杆菌供体菌株为罗斯氏inulinivorans 和真杆菌rectale 。质粒的模块性质及其通过自主复制在受体细菌中得以维持的能力使其成为研究异源基因表达的理想之选，并成为其他遗传工具（包括反义RNA沉默或II 型移动子中断子基因破坏策略）的平台。
[背景 ] 玫瑰菌和真细菌属人类肠道菌群中含量最高的细菌（Zhernakova 等，2016），它们通过利用饮食和宿主衍生的多糖影响人类健康（Scott 等，2006和2011； Cockburn 等） 。，2015 ; 谢里登等人，2016 ）并产生促进健康的代谢物丁酸作为发酵终产物（邓肯等人，2002和2006） 。另外，这些物种能够通过鞭毛调节宿主免疫（Neville ...
|
|
|
| Induction of Natural Competence in Genetically-modified Lactococcus lactis
|
|
Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] Natural competence can be activated in Lactoccocus lactis subsp lactis and cremoris upon overexpression of ComX, a master regulator of bacterial competence. Herein, we demonstrate a method to activate bacterial competence by regulating the expression of the comX gene by using a nisin-inducible promoter in an L. lactis strain harboring either a chromosomal or plasmid-encoded copy of nisRK. Addition of moderate concentrations of the inducer nisin resulted in concomitant moderate levels of ComX, which led to an optimal transformation rate (1.0 x 10-6 transformants/total cell number/g plasmid DNA). Here, a detailed description of the optimized protocol for competence induction is presented.
[摘要] 在过度表达细菌能力的主要调节因子ComX后，天然能力可以在乳酸乳球菌亚种乳酸和 cremoris 中激活。 在本文中，我们展示了通过在 L中使用乳链菌肽诱导型启动子调节 comX 基因的表达来激活细菌能力的方法。 含有 nisRK 的染色体或质粒编码拷贝的lactis 菌株。 加入中等浓度的诱导剂乳链菌肽导致伴随的中等水平的ComX，其导致最佳转化率（1.0×10 2 sup / -6>转化子/总细胞数/ g质粒DNA）。 在此，提出了用于能力归纳的优化协议的详细描述。
【背景】自然能力是细菌通过专门的摄取机制获得外源DNA的过程，之后内化的DNA整合到其基因组中或作为质粒DNA维持。一些细菌在特定的环境触发因素如基因毒性应激或饥饿时进入能力状态（Seitz和Blokesch，2013; Blokesch，2016）。群体感应系统，如 comCDE 或 comRS ，控制着革兰氏阳性菌的自然能力的激活（Håvarstein et al。，1995; Pestova et al。，1996; Kleerebezem et al。，1997b; Fontaine et al。，2015）。更具体地说， comC 和 comS 编码信息素，而 comD 编码组氨酸激酶和 comE 和 comR 编码响应调节器（Håvarstein et al。，1995; ...
|
|
|
| Markerless Gene Editing in the Hyperthermophilic Archaeon Thermococcus kodakarensis
|
|
Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] The advent of single cell genomics and the continued use of metagenomic profiling in diverse environments has exponentially increased the known diversity of life. The recovered and assembled genomes predict physiology, consortium interactions and gene function, but experimental validation of metabolisms and molecular pathways requires more directed approaches. Gene function–and the correlation between phenotype and genotype is most obviously studied with genetics, and it is therefore critical to develop techniques permitting rapid and facile strain construction. Many new and candidate archaeal lineages have recently been discovered, but experimental, genetic access to archaeal genomes is currently limited to a few model organisms. The results obtained from manipulating the genomes of ...
[摘要] 单细胞基因组学的出现以及在不同环境中宏基因组分析的持续使用已经成倍地增加了已知的生命多样性。恢复和组装的基因组预测生理，财团相互作用和基因功能，但代谢和分子途径的实验验证需要更直接的方法。基因功能 - 表型和基因型之间的相关性用遗传学得到最明显的研究，因此开发允许快速和容易地构建应变的技术是至关重要的。最近已经发现了许多新的和候选的古细菌谱系，但是对古细菌基因组的实验性，遗传途径目前仅限于一些模式生物。操纵这些基因可获得的生物的基因组所获得的结果已经对我们对古菌生理和信息处理系统的理解产生了深远的影响，这些持续的研究也有助于解决生命树的系统发育重建。超嗜热，浮游，海洋异养古细菌Thermococcus kodakarensis已经成为理想的遗传系统，其具有一系列可用于增加或减少编码活性的技术或修饰基因在体内的表达 。我们在这里概述一些技术，可以快速，无标记地删除单个，或者重复删除几个连续的从 T的序列。 kodakarensis 基因组。我们的程序包括构建转化所必需的质粒DNA的细节，所述质粒DNA通过同源重组指导整合到基因组中，鉴定已经整合了质粒序列的菌株（称为中间菌株）和确认质粒切除，导致最终菌株中的目标基因。可以使用几乎相同的程序来修饰而不是删除基因组基因座。
【背景】古细菌常常在看起来荒凉和迅速变化的环境中繁衍生息。古菌基因组的分析揭示了大量的代谢策略，预测了复杂和高度相互依赖的基因表达的调控网络，并揭示了许多基因，其蛋白质和日益稳定的RNA产物缺乏确定的功能。通过遗传操作挑战现有的和定义新的途径的能力已经辅助了古细菌生理学和信息处理系统的去卷积，并且最近开放了古细菌物种到合成和系统级的方法来定义细胞内和细胞间网络。 ...
|
|
|