| Preparation and Purification of Active Recombinant Human Pancreatic Lipase in Escherichia coli
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Author:
Date:
2019-07-05
[Abstract] Human pancreatic lipase (HPL) is the main lipolytic enzyme involved in the digestion of dietary fat. An active recombinant human pancreatic lipase (recHPL) was successfully prepared for the first time in an Escherichia coli (E. coli) expression system using a short Strep-tag II (ST II). The recHPL-ST II was solubilized with 8 M urea from the E. coli lysate and purified on a Strep-Tactin-Sepharose column. After refolding by stepwise dialyses against decreasing concentrations of urea in the presence of glycerol and Ca2+ for two days followed by gel filtration FPLC, 1.8-6 mg of active recHPL-ST II was obtained from 1 L of culture. Here we report the expression, purification, and optimized refolding procedures for active recHPL from E. coli, thus ...
[摘要] 人胰脂肪酶（HPL）是参与饮食脂肪消化的主要脂肪分解酶。 使用短Strep-tag II（STII）在大肠杆菌（E.coli）表达系统中首次成功制备了活性重组人胰脂肪酶（recHPL）。 将recHPL-ST II用来自大肠杆菌裂解物的8M尿素溶解，并在Strep-Tactin-Sepharose柱上纯化。 在甘油和Ca 2+ + 存在下通过逐步透析降低尿素浓度两天后重新折叠，然后进行凝胶过滤FPLC，从1L获得1.8-6mg活性recHPL-ST II。 文化。 在这里，我们报告来自 E的活性recHPL的表达，纯化和优化的重折叠程序。 大肠杆菌，从而将其建立为生产高纯度和扩大规模的recHPL的合适系统。
【背景】对膳食脂肪消化和吸收必不可少的哺乳动物脂肪酶可用于开发抗肥胖治疗。然而，获得纯的和稳定的天然哺乳动物脂肪酶一直是一个挑战，因为它经常被胰液中共存的蛋白酶降解。由于人体组织样本的有限性及其潜在的疾病传播风险，最好使用重组表达系统制备HPL。已经报道了几种使用酵母（Yang和Lowe，1998），昆虫（Thirstrup 等人，1993）或哺乳动物细胞（Canalias 等人）来表达recHPL的方法。 ，1994），分别需要培养至少5天，6天或10天。使用这些细胞获得的recHPL需要严格的质量控制以实现均一性，因为它们是差异糖基化的。使用 ...
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| In vitro Generation of CRISPR-Cas9 Complexes with Covalently Bound Repair Templates for Genome Editing in Mammalian Cells
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Author:
Date:
2019-01-05
[Abstract] The CRISPR-Cas9 system is a powerful genome-editing tool that promises application for gene editing therapies. The Cas9 nuclease is directed to the DNA by a programmable single guide (sg)RNA, and introduces a site-specific double-stranded break (DSB). In mammalian cells, DSBs are either repaired by non-homologous end joining (NHEJ), generating small insertion/deletion (indel) mutations, or by homology-directed repair (HDR). If ectopic donor templates are provided, the latter mechanism allows editing with single-nucleotide precision. The preference of mammalian cells to repair DSBs by NHEJ rather than HDR, however, limits the potential of CRISPR-Cas9 for applications where precise editing is needed. To enhance the efficiency of DSB repair by HDR from donor templates, we recently engineered ...
[摘要] CRISPR-Cas9系统是一种强大的基因组编辑工具，可用于基因编辑疗法。 Cas9核酸酶通过可编程单指导（sg）RNA导向DNA，并引入位点特异性双链断裂（DSB）。在哺乳动物细胞中，DSB通过非同源末端连接（NHEJ）修复，产生小的插入/缺失（indel）突变，或通过同源定向修复（HDR）。如果提供异位供体模板，则后一种机制允许以单核苷酸精确度进行编辑。然而，NHEJ而不是HDR对哺乳动物细胞修复DSB的偏好限制了CRISPR-Cas9在需要精确编辑的应用中的潜力。为了提高HDR从供体模板修复DSB的效率，我们最近设计了CRISPR-Cas9系统，其中模板DNA与Cas9酶结合。简而言之，单链寡核苷酸用O6-苄基鸟嘌呤（BG）标记，并与Cas9-SNAP-标签融合蛋白共价连接，形成核糖核蛋白-DNA（RNPD）复合物，由Cas9核酸酶，sgRNA和修复模板。在这里，我们提供了一个详细的协议如何生成O6-苄基鸟嘌呤（BG） - 连接的DNA修复模板，生产重组Cas9-SNAP-标签融合蛋白，体外转录单指导RNA，并转染RNPDs各种哺乳动物细胞。
【背景】CRISPR-Cas9系统有效地诱导定点DSB，其由细胞自主机制修复。由于哺乳动物细胞主要通过NHEJ修复DSB，因此CRISPR-Cas9系统主要在靶向基因座处引起indel突变。然而，对于许多应用，需要通过来自模板DNA的HDR进行精确修复。因此，已经进行了多次尝试以提高精确DSB修复的效率，包括修复途径的生化改变（Chu ...
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| α-Synuclein Aggregation Monitored by Thioflavin T Fluorescence Assay
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Author:
Date:
2018-07-20
[Abstract] Studying the aggregation of amyloid proteins like α-synuclein in vitro is a convenient and popular tool to gain kinetic insights into aggregation as well as to study factors (e.g., aggregation inhibitors) that influence it. These aggregation assays typically make use of the fluorescence dye Thioflavin T as a sensitive fluorescence reporter of amyloid fibril formation and are conducted in a plate-reader-based format, permitting the simultaneous screening of multiple samples and conditions. However, aggregation assays are generally prone to poor reproducibility due to the stochastic nature of fibril nucleation and the multiplicity of modulating factors. Here we present a simple and reproducible protocol to study the aggregation of α-synuclein in a plate-reader based assay.
[摘要] 研究淀粉样蛋白如α-突触核蛋白体外聚集是一种方便和流行的工具，可以获得聚集的动力学见解以及研究因子（例如，聚集抑制剂） 影响它。 这些聚集测定通常利用荧光染料硫磺素T作为淀粉样蛋白原纤维形成的敏感荧光报告物，并且以基于读板器的形式进行，允许同时筛选多个样品和条件。 然而，由于原纤维成核的随机性质和调节因子的多样性，聚集测定通常倾向于较差的再现性。 在这里，我们提出了一个简单和可重复的协议，以研究基于读板器的测定中α-突触核蛋白的聚集。
【背景】内源性蛋白质与淀粉样原纤维的聚集是一种致病过程，与几种疾病相关，例如，神经退行性疾病如阿尔茨海默病（AD）或帕金森病（PD）以及全身性疾病如AL淀粉样变性（ Knowles et al。，2014）。通过基于硫磺素T荧光的聚集测定，可以在基于板读者的装置中在体外中概括该过程，从而允许根据各种影响因素研究淀粉样蛋白的聚集动力学。
硫磺素T（ThT）是一种荧光染料，最初用于组织学样本中的淀粉样蛋白原纤维染色，于1959年由Vassar和Culling（Vassar和Culling，1959），其在体外检测和定量淀粉样纤维的应用
目前，硫代黄素T的聚集测定主要在荧光板读数器中进行，其中例如，96条件可以同时测试。由于原纤维成核的随机性质和影响蛋白质聚集的多种因素，这些测定法具有较差的重现性。因此，已经采用了增加ThT测定的再现性的策略，例如在测量期间使用井板的轨道摇动以及向孔中添加玻璃珠以改善混合（Giehm和Otzen，2010）。 ...
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