| Evaluation of Plasmid Stability by Negative Selection in Gram-negative Bacteria
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Author:
Date:
2017-05-05
[Abstract] Plasmid stability can be measured using antibiotic-resistance plasmid derivatives by positive selection. However, highly stable plasmids are below the sensitivity range of these assays. To solve this problem we describe a novel, highly sensitive method to measure plasmid stability based on the selection of plasmid-free cells following elimination of plasmid-containing cells. The assay proposed here is based on an aph-parE cassette. When synthesized in the cell, the ParE toxin induces cell death. ParE synthesis is controlled by a rhamnose-inducible promoter. When bacteria carrying the aph-parE module are grown in media containing rhamnose as the only carbon source, ParE is synthesized and plasmid-containing cells are eliminated. Kanamycin resistance (aph) is ...
[摘要] 可以通过阳性选择使用抗生素抗性质粒衍生物来测量质粒稳定性。然而，高度稳定的质粒低于这些测定的灵敏度范围。为了解决这个问题，我们描述了一种新颖的，高度灵敏的方法来测量质粒稳定性，这是基于在含有质粒的细胞消除后，无质粒细胞的选择。这里提出的检测方法是基于aph-parE 盒式磁带。当细胞合成时，ParE毒素诱导细胞死亡。 ParE合成由鼠李糖诱导型启动子控制。当携带 aph-parE 模块的细菌生长在含有鼠李糖作为唯一碳源的培养基中时，合成ParE，消除含有质粒的细胞。进一步使用卡那霉素抗性（ aph ）来证实在鼠李糖生长的细菌中不存在质粒。
背景 通过使用抗生素抗性质粒衍生物的阳性选择测定质粒稳定性。携带研究质粒的细胞在选择性抗生素（Gerdes等人，1985; del Solar等人，1987）的存在下被阳性选择。这种技术的主要缺点是其灵敏度;高度稳定的质粒低于这些测定的敏感性。为了解决这个问题，已经描述了依靠直接选择无质粒细胞例如 - 四环素系统的替代方法（Bochner等人，1980; Maloy和Nunn，1981; Garcia-Quintanilla 等人，2006）。 - ...
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| Measuring Caenorhabditis elegans Sleep during the Transition to Adulthood Using a Microfluidics-based System
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Author:
Date:
2017-03-20
[Abstract] C. elegans sleep during development is regulated by genes and cellular mechanisms that are conserved across the animal kingdom (Singh et al., 2014; Trojanowski and Raizen, 2016). C. elegans developmental sleep is usually assessed during the transition to adulthood, a 2.6 h time interval called lethargus (Raizen et al., 2008; Singh et al., 2011). During lethargus, animals cycle between periods of immobility (sleep bouts) and periods of active locomotion (motion bouts). Sleep bouts resemble sleep in other species based on behavioral criteria, including cessation of feeding and locomotion, increased arousal threshold for response to sensory stimulation, rapid reversibility, and homeostatic response to sleep loss. Several assays have been developed ...
[摘要] C。发展过程中的线虫睡眠受到动物界保护的基因和细胞机制的限制（Singh等人，2014; Trojanowski和Raizen，2016）。 C。线虫发育睡眠通常在成年过渡期间进行评估，2.6h时间间隔称为lethargus（Raizen等人，2008; Singh等人， 2011）。在嗜睡期间，动物在不动的时期（睡眠开始）和积极运动时期（运动发作）之间循环。睡眠状态基于行为标准，包括停止进食和运动，增加唤醒阈值以响应感觉刺激，快速可逆性和对睡眠损失的稳态反应，类似于其他物种的睡眠。已经开发了几种用于在C中研究睡眠的测定法。 （Belfer等人，2013; Bringmann，2011; Nelson等人，2013; Raizen等人， 2008）。在这里，我们提供了一个详细的评估方案。线虫在lethargus期间睡眠，许多研究组已经成功使用，结合简单的微流体室，具有照明系统的低成本照相机和基于图像减法的计算分析。我们注意到，这个系统可以很容易地适应于评估任何小动物的睡眠。
背景 C。睡眠通常根据运动停止进行评估，这是整个动物界睡眠的常见特征。由于C期间睡眠发作的间歇性。线虫发育睡眠，计算机视觉通常用于跟踪C的活动。线虫在lethargus期间。动物被约束到单个焦平面以保持它们的焦点。因为C.线虫可以通过长时间的游泳用尽液体（Ghosh和Emmons，2008），C。线虫 ...
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| Monoclonal Antibody Purification (Nicotiana benthamiana Plants)
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Author:
Date:
2014-01-20
[Abstract] Plant-based expression systems provide an alternative biomanufacturing platform for recombinant proteins (Matoba et al., 2011). In particular, plant virus-based vectors can overexpress proteins within days in the leaf tissue of Nicotiana benthamiana (N. benthamiana). To overcome the issues of genetic instability and limited infectivity of recombinant viruses, Agrobacterium-mediated delivery of “deconstructed” virus vectors has become the mainstay for the production of large and/or multicomponent proteins, such as immunoglobulin (Ig)G monoclonal antibodies (mAbs). Here, we describe a method of producing human IgG mAbs in N. benthamiana using the tobamoviral replicon vector magnICON®. The vector can express up to a few hundred mg of a ...
[摘要] 基于植物的表达系统为重组蛋白提供了替代的生物制造平台（Matoba等人，2011）。特别地，基于植物病毒的载体可以在烟草（Nicotiana benthamiana）（本塞姆氏烟草）的叶组织中天数内过表达蛋白质。为了克服重组病毒的遗传不稳定性和有限的感染性的问题，土壤杆菌介导的"解构的"病毒载体的递送已经成为生产大和/或多组分蛋白如免疫球蛋白的主要方法Ig）G单克隆抗体（mAb）。在这里，我们描述了在N中产生人IgG mAbs的方法。本生烟草使用烟草花叶病毒复制子载体magnICON 。载体在7天内可以表达高达几百mg的mAb/kg叶材料。显示了分别用于广泛中和的抗HIV和抗流感mAbs VRC01和CR6261的代表性病例（Hamorsky等人，2013）。叶组织匀浆，通过过滤和离心澄清提取物。 mAb通过快速蛋白质液相色谱（FPLC）使用蛋白A亲和力和Phenyl HP疏水界面树脂纯化。
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