| HCV Reporter System (Viral Infection-Activated Split-Intein-Mediated Reporter System) for Testing Virus Cell-to-cell Transmission ex-vivo
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Author:
Date:
2018-08-05
[Abstract] Hepatitis C virus (HCV) spread involves two distinct entry pathways: cell-free transmission and cell-to-cell transmission. Cell-to-cell transmission is not only an efficient way for viruses to spread but also an effective method for escaping neutralizing antibodies. We adapted the viral infection-activated split-intein-mediated reporter system (VISI) and developed a straightforward model for Live-cell monitoring of HCV cell-to-cell transmission ex-vivo: co-culture of HCV infected donor cells (red signal) with uninfected recipient cells (green signal) and elimination of the cell-free transmission by adding potent neutralizing antibody AR3A in the supernatant. With this model, the efficiency of cell-to-cell transmission can be evaluated by counting the number of foci designated by ...
[摘要] 丙型肝炎病毒（HCV）传播涉及两种不同的进入途径：无细胞传播和细胞间传播。 细胞间传播不仅是病毒传播的有效方式，也是逃避中和抗体的有效方法。 我们采用了病毒感染激活的分裂 - 内含肽介导的报告系统（VISI），并开发了一种直接模型，用于活细胞监测HCV细胞间传递离体：共培养 HCV感染的供体细胞（红色信号）与未感染的受体细胞（绿色信号）和通过在上清液中加入有效的中和抗体AR3A消除无细胞的传递。 利用该模型，可以通过计数受体细胞的绿色信号指定的病灶数来评估细胞间传递的效率。
【背景】越来越多的证据证明病毒可以在受感染的组织中使用不同的传播途径（Sattentau，2008; Zhong et al。，2013）。对于HCV传播，无细胞传播和细胞间传播均可介导肝细胞之间的病毒转移。虽然无细胞传播引发HCV感染，但认为细胞 - 细胞传递直接将HCV转移至相邻的肝细胞。它提供了抵抗中和抗体并有助于病毒持久性的极好方法（Brimacombe et al。，2011; Xiao et al。，2014）。之前的文章也证明了一些促进细胞传递的宿主因子，如清道夫受体BI（SR-BI），CD81，紧密连接蛋白claudin-1（CLDN1），Occludin（OCLN），表皮生长因子受体（EGFR）。 （Witteveldt et al。，2009; ...
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| Affinity Pulldown of Biotinylated RNA for Detection of Protein-RNA Complexes
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Author:
Date:
2016-12-20
[Abstract] RNA-binding proteins (RBPs) have recently emerged as crucial players in the regulation of gene expression. The interactions of RBPs with target mRNAs control the levels of gene products by altering different regulatory steps, including pre-mRNA splicing and maturation, nuclear mRNA export, and mRNA stability and translation (Glisovic et al., 2008). There are several methodologies available today to identify RNAs bound to specific RBPs; some detect only recombinant molecules in vitro, others detect recombinant and endogenous molecules, while others detect only endogenous molecules. Examples include systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX), biotinylated RNA pulldown assay, RNA immunoprecipitation (RIP) assay, electrophoretic mobility shift assay ...
[摘要] RNA结合蛋白（RBP）近来已经成为调控基因表达的关键因素。 RBP与靶mRNA的相互作用通过改变不同的调节步骤来控制基因产物的水平，包括mRNA前体剪接和成熟，核mRNA输出和mRNA稳定性和翻译（Glisovic et al。，2008） ）。目前有几种方法可用于鉴定与特定RBP结合的RNA;一些仅在体外检测重组分子，其他检测重组和内源性分子，而其他检测仅内源性分子。实例包括通过指数富集（SELEX），生物素化RNA下拉测定，RNA免疫沉淀（RIP）测定，电泳迁移率变动测定（EMSA），RNA足迹分析和各种UV交联和免疫沉淀（CLIP）方法如CLIP ，PAR-CLIP和iCLIP（Popova等人，2015）。在这里，我们描述了一种简单而有信息的方法来研究和鉴定RBP与其目标转录物之间相互作用的RNA区域（Panda等人，2014和2016）。其重现性和易用性使得该方案成为识别RBP与特异性RNA之间相互作用的快速有效的方法。
背景 RNA蛋白相互作用严重影响基因表达模式。这些核糖核蛋白（RNP）复合物的鉴定对于理解由RNA结合蛋白（RBP）控制的调控机制是必不可少的。最近，广泛的努力导致了开发用于系统分析RNA-蛋白质相互作用的方法。识别RNP复合物的高度信息化方法包括许多不同类型的RNP免疫沉淀（IP）分析。 ...
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| Cellular Translational Reporter Assay
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Author:
Date:
2014-03-20
[Abstract] The method described here allows measuring the effect of exogenously introduced modifications to in vitro-transcribed mRNA on the translation in cells. Using cells derived from knockout mice and control littermates, this method enables to compare the results in the presence or absence of specific gene products. In our lab, we used this protocol to check whether the exogenous addition of 5’ capping and 2’-O methylation to in vitro-mRNA affects the translational efficiency. Here we describe the details of our experiments.
[摘要] 本文所述的方法允许测量外部引入的修饰对体外转录的mRNA对细胞翻译的影响。 使用来自敲除小鼠和对照同窝出生的细胞，该方法能够比较存在或不存在特定基因产物的结果。 在我们的实验室中，我们使用该协议来检查外部添加5'帽化和2'-O甲基化在体外 -mRNA是否影响翻译效率。 这里我们描述我们的实验的细节。
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