| Protocol for Notch-ligand Binding Assays Using Dynabeads
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Author:
Date:
2017-10-20
[Abstract] This protocol describes how to measure interaction between Notch receptors and their ligands by cell-based assay using Dynabeads. We have used the protocol to determine binding capacity between Notch1-transfected HEK293T cells and ligand-coated Dynabeads. Expression of Eogt in Notch1-expressing cells promoted binding toward DLL4-coated beads, but not JAG1-coated beads. The Notch-ligand assay using Dynabeads suggested that Eogt facilitates DLL4-Notch1 interaction (Sawaguchi et al., 2017).
[摘要] 该协议描述了如何使用Dynabeads通过基于细胞的测定来测量Notch受体及其配体之间的相互作用。 我们已经使用方案来确定Notch1转染的HEK293T细胞和配体包被的Dynabeads之间的结合能力。 在Notch1表达细胞中表达Eogt 促进了对DLL4包被的珠粒的结合，而不是JAG1包被的珠粒。 使用Dynabeads的Notch-配体测定表明，Eogt 有助于DLL4-Notch1相互作用（Sawaguchi等人，2017）。
【背景】Notch信号通路调节许多类型的细胞事件，如所有后生动物中的增殖，细胞命运测定和细胞分化（Mumm和Kopan，2000）。为了启动Notch信号传导，Notch受体的细胞外结构域与其配体结合，呈现在相对细胞上的Delta样（DLL）配体或Jagged（JAG）配体）。
Notch受体的表皮生长因子（EGF）样结构域对配体结合至关重要，并由包含O-岩藻糖，O-葡萄糖和O-GlcNAc聚糖的特定聚糖修饰（Stanley和Okajima，2010）。这些聚糖中的一些通过调节Notch受体和配体之间的物理相互作用（Moloney等人，2000）用作Notch信号传导途径的调节剂。为了研究O-GlcNAc是否调节Notch-配体相互作用，我们开发了一种基于Dynabeads的Notch-配体结合测定。在该测定中，在HEK293T细胞上表达的Notch受体与用DLL4-Fc或JAG1-Fc包被的Dynabeads蛋白A孵育。与用于其他结合测定法的可溶性配体不同，Notch配体的方向固定在珠上，使得它们表现得像配体表达细胞。因此，检测到的结合表示反式结合而不是顺式结合，当Notch受体及其配体在相同的细胞中表达时发生。该测定表明，通过Eogt ...
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| RNA-binding Protein Immunoprecipitation (RIP) to Examine AUF1 Binding to Senescence-Associated Secretory Phenotype (SASP) Factor mRNA
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Author:
Date:
2015-05-20
[Abstract] Immunoprecipitation and subsequent isolation of nucleic acids allows for the investigation of protein:nucleic acid interactions. RNA-binding protein immunoprecipitation (RIP) is used for the analysis of protein interactions with mRNA. Combining RIP with quantitative real-time PCR (qRT-PCR) further enhances the RIP technique by allowing for the quantitative assessment of RNA-binding protein interactions with their target mRNAs, and how these interactions change in different cellular settings. Here, we describe the immunoprecipitation of the RNA-binding protein AUF1 with several different factors associated with the senescence-associated secretory phenotype (SASP) (Alspach and Stewart, 2013), specifically IL6 and IL8. This protocol was originally published in Alspach et al. (2014).
[摘要] 免疫沉淀和随后的核酸分离允许研究蛋白质：核酸相互作用。 RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）用于分析蛋白质与mRNA的相互作用。 结合RIP与定量实时PCR（qRT-PCR）通过允许RNA结合蛋白与其靶mRNA的相互作用的定量评估以及这些相互作用在不同细胞设置中如何变化来进一步增强RIP技术。 在这里，我们描述RNA结合蛋白AUF1与几种不同的因素与衰老相关的分泌表型（SASP）（Alspach和斯图尔特，2013年），特别是IL6和IL8相关的免疫沉淀。 该协议最初发表在Alspach等人（2014）。
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| Co-immunoprecipitation in Yeast
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Author:
Date:
2012-08-20
[Abstract] This protocol describes investigation of protein-protein interactions in baker yeast by co-immunoprecipitation (CoIP). CoIP is a technique to identify physiologically relevant protein-protein interactions in the cell. The interesting protein can be isolated out of solution using antibody that specifically binds to that particular protein (antigene protein). The partner proteins that are bound to a specific target protein can be co-immunoprecipitated together with an antigen. These protein complexes can then be analyzed to identify new binding partners, binding affinities, the kinetics of binding and the function of the target protein. Here I describe the protocols that allow to immunoprecipitate different protein complexes, for example NAC complex (Panasenko et al., 2009), ...
[摘要] 该协议描述了通过共免疫沉淀（CoIP）对面包酵母中蛋白质 - 蛋白质相互作用的研究。 CoIP是鉴定细胞中生理相关的蛋白质 - 蛋白质相互作用的技术。 使用特异性结合该特定蛋白（抗原蛋白）的抗体可以从溶液中分离出感兴趣的蛋白。 与特定靶蛋白结合的伴侣蛋白可以与抗原一起免疫共沉淀。 然后可以分析这些蛋白质复合物以鉴定新的结合配偶体，结合亲和力，结合的动力学和靶蛋白的功能。 这里我描述允许免疫沉淀不同蛋白复合物的方案，例如NAC复合物（Panasenko等人，2009），Ccr4-Not复合物（Panasenko和Collort，2011），核糖体（Panasenko和Collort ，2012），并调查他们的合作伙伴。 对于每个CoIP，我使用不同的裂解缓冲液，如下文配方中所示。
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