| Expression and Purification of Arabidopsis Transmembrane Protein BCM1 in Saccharomyces cerevisiae
|
|
Author:
Date:
2020-09-20
[Abstract] Heterologous expression and purification of transmembrane proteins have remained a challenge for decades hampering detailed biochemical and structural characterization of key enzymes and their interacting regulators in multiple metabolic pathways. An in-depth study on the newly identified Arabidopsis thaliana integral membrane protein BALANCE OF CHLOROPHYLL METABOLISM 1 (BCM1) showed a stimulatory effect of the BCM1 on magnesium chelatase, the first enzyme of chlorophyll biosynthesis, through interaction with the GENOMES UNCOUPLED 4 (Wang et al., 2020). Here, we report a detailed and optimized method for heterologous expression and purification of His-tagged BCM1 in Saccharomyces cerevisiae. Following this method, we obtained native BCM1 used for in vitro ...
[摘要] [摘要 ] 异源表达和公顷跨膜蛋白的纯化VE 仍然几十年来阻碍了关键酶详述生物化学和结构表征一个挑战小号和它们的相互作用调节在多个代谢途径。上新鉴定进行了深入的研究拟南芥拟南芥叶绿素代谢1（BCM1）的整合膜蛋白BALANCE显示一个通过与相互作用对镁螯合，叶绿素生物合成的第一个酶，所述BCM1的刺激效应基因组中脱开4 （王等等人，2020）。这里 ，我们报告了酿酒酵母中His-tagged BCM1异源表达和纯化的详细和优化方法。˚F ollowing这种方法，我们获得用于本机BCM1 体外酶测定的镁螯合（王等人，2020） 。目前，BCM1的结晶研究正在进行中。这个协议可以适于纯化BCM 1一样从用于酶和结构研究真核生物的跨膜蛋白。
[背景 ] 鉴定翻译后单组的lators其指导LY 调制enzym 一个叶绿素合成的酶的抽动活动可以大大提高我们理解的分子机制，通过该植物保持高效叶绿素叶期间LL合成绿化（Brzezowski 等人，2015年）。然而，叶绿素合成酶及其相互作用蛋白的详细生化分析受到体外重组蛋白可用性的限制。我们最近发现一个叶绿素代谢1（BCM1）的翻译后调节平衡，同时刺激小号叶绿素合成和延迟叶绿素分解，日ERE 被授予叶发育过程中的叶绿素稳态（王等人，2020年）。为了检查BCM1对镁螯合酶（MgCh ...
|
|
|
| Separation of Thylakoid Protein Complexes with Two-dimensional Native-PAGE
|
|
Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] The hierarchical composition and interactions of the labile thylakoid protein complexes can be assessed by sequential 2D-native gel-electrophoresis system. Mild non-ionic detergent digitonin is used to solubilize labile protein super-and megacomplexes, which are then separated with first-dimension blue native polyacrylamide gel electrophoresis (1D-BN-PAGE). The digitonin derived protein complexes are further solubilized with stronger detergent, β-DM, and subsequently separated on an orthogonal 2D-BN-PAGE to release smaller protein subcomplexes from the higher-order supercomplexes. Here we describe a detailed method for 2D-BN-PAGE analysis of thylakoid protein complexes from Arabidopsis thaliana.
[摘要] 不稳定的类囊体蛋白复合物的分级组成和相互作用可以通过连续的2D天然凝胶电泳系统来评估。 温和的非离子洗涤剂洋地黄皂苷用于溶解不稳定的蛋白质超级和巨型复合物，然后用第一维蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（1D-BN-PAGE）分离。 将洋地黄皂苷衍生的蛋白质复合物用更强的去污剂β-DM进一步溶解，随后在正交的2D-BN-PAGE上分离，以从较高级的超复合物中释放较小的蛋白质亚复合物。 在这里，我们描述了来自拟南芥的类囊体蛋白复合物的2D-BN-PAGE分析的详细方法。
【背景】在类囊体膜中发生光合作用的光反应，在高等植物中，由贴壁的grana类囊体和非贴壁的基质类囊体组成。光反应由多亚基蛋白复合物光系统（PS）I和II，细胞色素b 6 f和ATP酶催化。 PSII及其光捕获天线复合物（LHCII）在grana-thylakoids中最为丰富，因此在空间上与基质类囊体定位的PSI-LHCI复合物隔离（Andersson和Anderson，1980）。格拉纳和基质类囊体之间的间期在两个光系统中都得到了丰富（Albertsson，2001; Suorsa et al。，2015）。通过光依赖性LHCII和PSII蛋白的可逆磷酸化介导，光系统与LHCII一起组装成更大的超级和超级复合物。 ...
|
|
|
| Investigating the Assembly Status of the Plastid Encoded Polymerase Using BN-PAGE and Sucrose Gradient Centrifugation
|
|
Author:
Date:
2016-07-20
[Abstract] The plastid encoded polymerase (PEP) represents a major transcription machinery in mature chloroplasts (Liere et al., 2011; Zhelyazkova et al., 2012). The proper assembly of this multi-subunit complex is important for plant growth and development (Pfalz and Pfannschmidt, 2013). The PEP polymerase can be purified from soluble and from membrane-bound (also named transcriptionally active chromosome, TAC) fractions. Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and sucrose gradient sedimentation followed by immunoblot analyses is used to detect the status of the PEP complex assembly.
[摘要] 质体编码聚合酶（PEP）代表成熟叶绿体中的主要转录机制（Liere等人，2011; Zhelyazkova等人，2012）。 这种多亚基复合物的正确装配对于植物生长和发育是重要的（Pfalz和Pfannschmidt，2013）。 PEP聚合酶可以从可溶性和膜结合（也称为转录活性染色体，TAC）级分中纯化。 蓝色使用天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）和蔗糖梯度沉淀，随后进行免疫印迹分析来检测PEP复合物组装体的状态。
|
|
|