| Visualization of RNA 3’ ends in Escherichia coli Using 3’ RACE Combined with Primer Extension
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Author:
Date:
2018-03-05
[Abstract] In this assay, 3’ RACE (Rapid Amplification of cDNA 3’ Ends) followed by PE (primer extension), abbreviated as 3’ RACE-PE is used to identify the mRNA 3’ ends. The following protocol describes the amplification of the mRNA 3’ ends at the galactose operon in E. coli and the corresponding visualization of the PCR products through PE. In PE, the definite primer is 5’ end-labeled using [γ-(32) P] ATP and T4 polynucleotide kinase, which anneals to the specific DNA molecules within the PCR product of the 3’ RACE. The conventional PE can only be used to locate the 5’ end of an mRNA transcript since reverse transcriptase (RTase) polymerizes only in the 5’ → 3’ direction. Thus, Taq polymerase is used instead of RTase, PCR is performed. Therefore, we are able to locate the 3’ end of the ...
[摘要] 在该测定中，使用缩写为3'RACE-PE的3'RACE（cDNA3'末端快速扩增），随后是PE（引物延伸），以鉴定mRNA3'末端。以下方案描述E中半乳糖操纵子的mRNA 3'末端的扩增。并通过PE对相应的PCR产物进行可视化。在PE中，使用[γ-（32）P] ATP和T4多核苷酸激酶对确定的引物进行5'末端标记，其退火至3'RACE的PCR产物内的特定DNA分子。由于逆转录酶（RTase）仅在5'→3'方向聚合，常规PE只能用于定位mRNA转录物的5'末端。因此，使用Taq聚合酶代替RTase，进行PCR。因此，我们能够使用此测定法定位mRNA的3'末端。通过在变性8％尿素-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）凝胶中分离DNA产物，可以直接显示和定量3'末端的相对量。 3'末端的确切位置可以通过比较这些最终的DNA产物与相应的DNA测序阶梯进行测序。
【背景】mRNA 3'末端的合成是E中的重要步骤。产生稳定的信使RNA（mRNA）的大肠杆菌。在真核细胞中，mRNA 3'末端形成是通过从内部磷酸二酯键切割，然后加入聚（A）尾;而在原核细胞中，通过终止转录或通过加工初级转录产生mRNA的3'末端（Altman和Robertson，1973; Nudler和Gottesman，2002; Zhao等人，1999年）。因此，分析mRNA ...
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| Snapshots of the Signaling Complex DesK:DesR in Different Functional States Using Rational Mutagenesis and X-ray Crystallography
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Author:
Date:
2017-08-20
[Abstract] We have developed protocols to generate site-specific variants of the histidine-kinase DesK and its cognate response regulator DesR, conducive to trapping different signaling states of the proteins. Co-expression of both partners in E. coli, ensuring an excess of the regulator, was essential for soluble production of the DesK:DesR complexes and further purification. The 3D structures of the complex trapped in the phosphotransferase and in the phosphatase reaction steps, were solved by X-ray crystallography using molecular replacement. The solution was not trivial, and we found that in silico-generated models used as search probes, were instrumental to succeeding in placing a large portion of the complex in the asymmetric unit. Electron density maps were then clear enough ...
[摘要] 我们已经开发了产生组氨酸激酶DesK及其同源反应调节物DesR的位点特异性变体的方案，有助于捕获蛋白质的不同信号状态。两个合作伙伴在大肠杆菌中的共表达，确保调节剂过量，对于DesK：DesR复合物的可溶性生产和进一步纯化是至关重要的。通过使用分子置换的X射线晶体学解决了捕获在磷酸转移酶和磷酸酶反应步骤中的复合物的3D结构。该解决方案不是微不足道的，我们发现在用作搜索探针的硅片生成的模型中，有助于将大部分复合物放置在不对称单元中。电子密度图就足够清楚了，可以进行人工建模，获得完整的原子模型。这些方法有助于解决细菌信号领域的主要挑战，即获得稳定的激酶：调节复合物，具有不同的构象状态，适用于高分辨率晶体学研究。
【背景】关于细菌信号复合物，特别是双组分系统（TCS）的结构信息仍然很少（Casino et al。，2009; Gao and Stock，2009）。 TCS包含几乎所有细菌中的感觉组氨酸激酶（HK）和响应调节剂（RR）配偶体，它们允许细胞感知环境并通过适应性反应相应地反应。尽管在信号传输中这种切换机制的重要性（Trajtenberg等，2016），结构信息对于采用不同功能状态的TCS复合体甚至更为有限。我们研究了DesK-DesR途径（de Mendoza，2014），一种来自枯草芽孢杆菌的TCS，其参与调节细胞膜组成以适应降低双层流动性的线索，如冷休克。 ...
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| Investigating the Assembly Status of the Plastid Encoded Polymerase Using BN-PAGE and Sucrose Gradient Centrifugation
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Author:
Date:
2016-07-20
[Abstract] The plastid encoded polymerase (PEP) represents a major transcription machinery in mature chloroplasts (Liere et al., 2011; Zhelyazkova et al., 2012). The proper assembly of this multi-subunit complex is important for plant growth and development (Pfalz and Pfannschmidt, 2013). The PEP polymerase can be purified from soluble and from membrane-bound (also named transcriptionally active chromosome, TAC) fractions. Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and sucrose gradient sedimentation followed by immunoblot analyses is used to detect the status of the PEP complex assembly.
[摘要] 质体编码聚合酶（PEP）代表成熟叶绿体中的主要转录机制（Liere等人，2011; Zhelyazkova等人，2012）。 这种多亚基复合物的正确装配对于植物生长和发育是重要的（Pfalz和Pfannschmidt，2013）。 PEP聚合酶可以从可溶性和膜结合（也称为转录活性染色体，TAC）级分中纯化。 蓝色使用天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）和蔗糖梯度沉淀，随后进行免疫印迹分析来检测PEP复合物组装体的状态。
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