| In vitro mTORC1 Kinase Assay for Mammalian Cells Protocol
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Author:
Date:
2016-06-05
[Abstract] Historically, mechanistic target of rapamycin (mTOR) was purified from mammalian cells using mild nonionic detergents such as NP-40 and or Triton-X100 that resulted in dissociation of core regulatory components essential for its native kinase activity. Consequently, these older kinase assays required MnCl2 to artificially enhance the weak phosphotransfer activity observed (Bai et al., 2007; Kim et al., 2002). With the use of the zwitterionic detergent 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS), the mTOR complex 1 (mTORC1) containing Regulatory-associated protein of mTOR (Raptor) and Lst8 (also known as GbetaL) can be successfully purified as a complex. This in vitro kinase assay allows for purification of mTORC1 that resembles ...
[摘要] 历史上，使用温和的非离子去污剂如NP-40和或Triton-X100从哺乳动物细胞纯化雷帕霉素（mTOR）的机械目标，导致其天然激酶活性所必需的核心调节组分的解离。因此，这些较老的激酶测定需要MnCl 2以人工增强观察到的弱磷酸转移活性（Bai等人，2007; Kim等人）。 ，2002）。使用两性离子去污剂3 - [（3-胆碱酰氨基丙基）二甲基铵基] -1-丙磺酸盐（CHAPS），含有mTOR（Raptor）和Lst8（也称为GbetaL）的调节相关蛋白的mTOR复合物1（mTORC1）可以成功地纯化为复合物。这种体外激酶测定允许纯化类似于其生理状态并在生理性MgCl 2浓度下保持激酶活性的mTORC1（Sancak等人）。 ，2007）。 mTORC1的活性可以通过使用mTOR的激酶结构域内的过度活跃突变或包含补充到体外激酶测定中的富含脑部（Rheb）的GTP结合的RAS来进一步增强。 Rheb是结合并激活mTORC1以磷酸化下游底物的小G蛋白，例如真核起始因子4E-BP1（4E-BP1）（Burnett等人，1998），核糖体蛋白S6激酶1（S6K1）（Kim等人，2002），信号转导物和转录激活因子3（STAT3）（Dodd等人，2015）和脯氨酸富集的40kDa的Akt底物（PRAS40）（Dunlop等人，2009）。
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| Identification of Factors in Regulating a Protein Ubiquitination by Immunoprecipitation: a Case Study of TRF2 on Human REST4 Ubiquitination
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Author:
Date:
2015-07-05
[Abstract] Ubiquitination is the first step of the ubiquitin-proteasome pathway that regulates cells for their homeostatic functions and is an enzymatic, protein post-translational modification process in which ubiquitin is transferred to a target protein substrate by a set of three ubiquitin enzymes (Weissman et al., 2011; Bhattacharyya et al., 2014; Ristic et al., 2014). Given the importance of this process, it is plausible that ubiquitination is under strict control by many factors and that the regulatory machineries are protein-specific. An assay for the detection of a specific protein ubiquitination will enable us to examine whether a factor has a function to regulate the ubiquitination of this protein. Here we describe a protocol that detects the ubiquitination ...
[摘要] 泛素化是泛素 - 蛋白酶体通路的第一步，其调节细胞的内环境稳定功能，并且是酶，蛋白质翻译后修饰过程，其中通过一组三种泛素酶将泛素转移到靶蛋白质底物（Weissman et al。，2011; Bhattacharyya et al。，2014; Ristic 等人，2014）。考虑到这一过程的重要性，似乎可能的是，泛素化受到许多因素的严格控制，并且调节机制是蛋白质特异性的。用于检测特异性蛋白泛素化的测定将使我们能够检查因子是否具有调节该蛋白的泛素化的功能。在这里我们描述一个协议，检测人类REST4蛋白在培养细胞中的神经选择性剪接异构体（RE-1沉默转录因子），拮抗REST对神经分化和神经元形成的镇压功能的泛素化状态。使用这个协议，我们显示端粒结合蛋白TRF2通过抑制其泛素化稳定人类REST4的表达。这表明TRF2在神经分化中发挥阳性作用（Ovando-Roche等人，2014）。该方案还可用于检测其他感兴趣的蛋白质的泛素化。
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