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Author:
Date:
2016-06-05
[Abstract] Historically, mechanistic target of rapamycin (mTOR) was purified from mammalian cells using mild nonionic detergents such as NP-40 and or Triton-X100 that resulted in dissociation of core regulatory components essential for its native kinase activity. Consequently, these older kinase assays required MnCl2 to artificially enhance the weak phosphotransfer activity observed (Bai et al., 2007; Kim et al., 2002). With the use of the zwitterionic detergent 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS), the mTOR complex 1 (mTORC1) containing Regulatory-associated protein of mTOR (Raptor) and Lst8 (also known as GbetaL) can be successfully purified as a complex. This in vitro kinase assay allows for purification of mTORC1 that resembles ...
[摘要] 历史上，使用温和的非离子去污剂如NP-40和或Triton-X100从哺乳动物细胞纯化雷帕霉素（mTOR）的机械目标，导致其天然激酶活性所必需的核心调节组分的解离。因此，这些较老的激酶测定需要MnCl 2以人工增强观察到的弱磷酸转移活性（Bai等人，2007; Kim等人）。 ，2002）。使用两性离子去污剂3 - [（3-胆碱酰氨基丙基）二甲基铵基] -1-丙磺酸盐（CHAPS），含有mTOR（Raptor）和Lst8（也称为GbetaL）的调节相关蛋白的mTOR复合物1（mTORC1）可以成功地纯化为复合物。这种体外激酶测定允许纯化类似于其生理状态并在生理性MgCl 2浓度下保持激酶活性的mTORC1（Sancak等人）。 ，2007）。 mTORC1的活性可以通过使用mTOR的激酶结构域内的过度活跃突变或包含补充到体外激酶测定中的富含脑部（Rheb）的GTP结合的RAS来进一步增强。 Rheb是结合并激活mTORC1以磷酸化下游底物的小G蛋白，例如真核起始因子4E-BP1（4E-BP1）（Burnett等人，1998），核糖体蛋白S6激酶1（S6K1）（Kim等人，2002），信号转导物和转录激活因子3（STAT3）（Dodd等人，2015）和脯氨酸富集的40kDa的Akt底物（PRAS40）（Dunlop等人，2009）。
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