| Conditional Knockdown of Proteins Using Auxin-inducible Degron (AID) Fusions in Toxoplasma gondii
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Author:
Date:
2018-02-20
[Abstract] Toxoplasma gondii is a member of the deadly phylum of protozoan parasites called Apicomplexa. As a model apicomplexan, there is a great wealth of information regarding T. gondii’s 8,000+ protein coding genes including sequence variation, expression, and relative contribution to parasite fitness. However, new tools are needed to functionally investigate hundreds of putative essential protein coding genes. Accordingly, we recently implemented the auxin-inducible degron (AID) system for studying essential proteins in T. gondii. Here we provide a step-by-step protocol for examining protein function in T. gondii using the AID system in a tissue culture setting.
[摘要] 弓形虫是原生动物寄生虫称为Apicomplexa致命门的一员。 作为一个复杂的模型，关于T的信息有很多。 gondii的8,000多种蛋白质编码基因，包括序列变异，表达和对寄生虫适应的相对贡献。 然而，需要新的工具来功能性地调查数百个推定的必需蛋白质编码基因。 因此，我们最近实施了生长素诱导降解（AID）系统来研究T中的基本蛋白质。弓形虫。 在这里，我们提供了一个检查蛋白质功能的一步一步的协议。 在组织培养环境中使用AID系统。
【背景】生长素是一类通过靶向某些蛋白质在植物中进行蛋白酶体降解而发出信号的植物激素（Teale等人，2006）。 Kohei Nishimura等人具有将该植物特异性信号传导系统的组分转移到其他真核生物中用于有兴趣的蛋白质（POI）的条件调节，创建生长素诱导降解（AID）系统的聪明想法（Nishimura等人，2009）。这个系统已经被成功地用于几种真核生物，包括疟原虫疟原虫（Kreidenweiss et al。，2013; Philip和Waters，2015）。只需要两个转基因成分来实现这个系统，称为转运抑制剂反应1（TIR1）的植物生长素受体和用AID标记的POI。用生长素（例如，3-吲哚乙酸/ IAA）处理活化SCF ...
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| Gliding Assay to Analyze Microtubule-based Motor Protein Dynamics
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] The purpose of this protocol is to provide an updated method of performing microtubule gliding assays and visualizing it using fluorescence microscopy.
[摘要] 该协议的目的是提供一种更新的微管滑翔测定方法，并使用荧光显微镜对其进行可视化。
有丝分裂主轴是主导有丝分裂的蛋白质机械。有丝分裂纺锤体利用基于微管的运动蛋白来组织自身，并施加力量驱动细胞分裂。基于微管的运动蛋白使用源自ATP水解的能量产生机械工作（Coppin等人，1997）。运动蛋白以单向方式转移微管。运动的行为可以通过体外滑行测定（Tao和Scholey，2010）来观察，其中将电机固定在玻璃表面上并提供微管和ATP。然后可以使用荧光显微镜研究运动蛋白的运动性，并且可以实时观察其动态行为的细节。该更新的方案将允许使用体外微管滑动测定法（Tao等人，2006和2016）分析基于微管的运动蛋白功能。
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| In vitro Microtubule Bundling Assay under Physiological Conditions
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] Kinesins play a role in organizing the mitotic spindle through the crosslinking of microtubules (MTs), made possible through binding sites at opposite ends of the holoenzyme. Here, we developed a method to test kinesin MT crosslinking action under physiological conditions.
[摘要] 驱动蛋白通过微管（MT）的交联来组织有丝分裂纺锤体，通过在全酶的相对端的结合位点成为可能。在这里，我们开发了一种在生理条件下测试驱动蛋白MT交联作用的方法。
基于微管的运动蛋白是重要的，因为它们使用ATP的化学能产生力以便向量转移微管（MT）。在这些基于MT的运动蛋白中，称为驱动蛋白的超家族负责定向运输和沿微管的运动。一些运动蛋白在全酶的两端具有MT结合位点，因此它们可以在生理ATP条件下将MT交联成束（Tao等人，2006）。由于这种捆绑活动，它们在组织和维持有丝分裂纺锤体方面具有重要作用，其主要作用取决于其微管的极性模式（van den Wildenberg等人，2008）。以前的捆绑测定不包括ATP，或者使用可以产生人为结果的不可水解的ATP类似物。这里我们开发了一种使用生理ATP条件的方法。通过纯化这些全长运动蛋白，它使我们能够在生理条件下测定其交联活性。
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