| A Small RNA Isolation and Sequencing Protocol and Its Application to Assay CRISPR RNA Biogenesis in Bacteria
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Author:
Date:
2018-02-20
[Abstract] Next generation high-throughput sequencing has enabled sensitive and unambiguous analysis of RNA populations in cells. Here, we describe a method for isolation and strand-specific sequencing of small RNA pools from bacteria that can be multiplexed to accommodate multiple biological samples in a single experiment. Small RNAs are isolated by polyacrylamide gel electrophoresis and treated with T4 polynucleotide kinase. This allows for 3’ adapter ligation to CRISPR RNAs, which don’t have pre-existing 3’-OH ends. Pre-adenylated adapters are then ligated using T4 RNA ligase 1 in the absence of ATP and with a high concentration of polyethylene glycol (PEG). The 3’ capture step enables precise determination of the 3’ ends of diverse RNA molecules. Additionally, a random hexamer in the ligated ...
[摘要] 新一代高通量测序技术能够对细胞中的RNA群体进行敏感和明确的分析。在这里，我们描述了一种从细菌中分离和链特异性测序小RNA池的方法，所述细菌可以在单个实验中多路复用以容纳多个生物样品。小RNA通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并用T4多核苷酸激酶处理。这允许3'衔接头连接至CRISPR RNA，其不具有预先存在的3'-OH末端。然后使用T4 RNA连接酶1在不存在ATP和高浓度聚乙二醇（PEG）的情况下将前腺苷酸化的衔接子连接。 3'捕获步骤能够精确测定不同RNA分子的3'末端。此外，连接适配器中的随机六聚体有助于控制潜在的下游扩增偏差。逆转录后，将cDNA产物环化并通过PCR制备文库。我们显示扩增的文库不需要通过凝胶电泳可见，以期望产物的有效测序。使用这种方法，我们通常从少量纯化的小RNA制备RNA测序文库。该协议适合于通过对成熟的CRISPR RNA进行测序来测定细菌中的CRISPR RNA生物合成，但可以用于测序不同类型的小RNA。我们还提供了一个完整的数据处理管道示例，并提供了运行所提供脚本的说明。
【背景】与聚集的经常散布的短回文重复序列（CRISPR）相关的遗传模块赋予不同的原核宿主适应性免疫（Barrangou et ...
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| Extraction of DNA from Murine Fecal Pellets for Downstream Phylogenetic Microbiota Analysis by Next-generation Sequencing
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] Mouse models are widely used to evaluate the potential impact of the gut microbial composition on health and disease. Standardized protocols for sampling and storing murine feces, as well as for extracting DNA from these fecal pellets are needed to limit experimental variation between different studies. Both efficient lysis of the microbiota and the quality of the obtained fecal DNA are important for allowing the downstream next-generation sequencing to cover the phylogenetic diversity of both Gram-negative and Gram-positive bacteria living in the mouse gut. Here we present a detailed protocol for fecal sample collection and DNA extraction that we validated in a study on the impact of inflammasomes on the murine gut microbiota. This protocol for DNA extraction from murine fecal pellets ...
[摘要] 小鼠模型被广泛用于评估良好的微生物组成对健康和疾病的潜在影响。 为了限制不同研究之间的实验差异，需要用于取样和储存鼠粪的标准化方案，以及从这些粪便颗粒中提取DNA。 微生物群的有效裂解和产生的粪便DNA对于允许下游的下一代测序覆盖革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的系统发育多样性是重要的。 在这里，我们提出了一个详细的粪便样本采集和DNA提取方案，我们在炎症小鼠对小鼠肠道微生物群的影响的研究中进行了验证。 这种从鼠粪球中提取DNA的方案利用了机械和化学溶解的组合，这与最近推荐的用于从人类粪便中提取DNA的基准方案一致。
【背景】限制实验室内部和实验室之间的技术变化对于再现性是必要的，因此也是实验研究的科学进步所必需的。在扩大的肠道微生物群研究群体中，使用了大量的方法来描述肠道生态系统的系统发育成分。微生物学分析过程中的每个步骤都受到技术变化的影响。例如，来自鼠粪便的DNA据报道在同一实验室中获得的结果有多重差异（Ferrand等，2014）。因此，有必要对多个不同研究进行荟萃分析。
为了分析人类粪便微生物研究人员组成的大型国际财团日前相比，在几个独立的实验室以及微生物分析流水线的每一个步骤的许多技术方法的效果（科斯泰亚的等的，2017年） ...
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| Protocol for Establishing a Multiplex Image-based Autophagy RNAi Screen in Cell Cultures
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] Autophagy is a recycling pathway, in which intracellular cargoes including protein aggregates and bacteria are engulfed by autophagosomes and subsequently degraded after fusion with lysosomes. Dysregulation of this process is involved in several human diseases such as cancer or neurodegeneration. Hence, advancing our understanding of how autophagy is regulated provides an opportunity to explore druggable targets and subsequently develop treatment strategies for these diseases. To identify novel autophagy regulators, we developed an image-based phenotypic RNAi screening approach using autophagic marker proteins at endogenous levels (Jung et al., 2017). In contrast to previously performed autophagy screens, this approach does not use overexpressed, tagged autophagy marker proteins ...
[摘要] 自噬是一种循环途径，其中细胞内货物包括蛋白质聚集体和细菌被自噬吞噬，随后与溶酶体融合后降解。这种过程的失调涉及几种人类疾病，如癌症或神经退行性疾病。因此，提高我们对自噬如何监管的理解提供了探索可药用靶标的机会，并随后制定了这些疾病的治疗策略。为了鉴定新的自噬调节因子，我们开发了一种基于图像的表型RNAi筛选方法，在内源水平上使用自噬标记蛋白（Jung et al。，2017）。与以前进行的自噬屏幕相比，该方法不使用过表达标记的自噬标记蛋白，而是在内源水平检测自噬结构。此外，我们同时监测自噬的早期和晚期阶段，而其他筛选仅使用单个自噬体标志物大多为GFP-LC3B。在这里，我们详细描述了这种多重筛选方案，并讨论了如何建立基于图像的siRNA筛选的一般考虑。
【背景】自噬是一种细胞内质量和数量控制途径，通过这种途径，多种细胞溶质材料如病原体，细胞器或其部分，蛋白质和其他大分子被双重膜结构所吞噬，造成自噬体，并在自噬体与溶酶体融合后进行大量溶酶体降解。自体吞噬体的形成及其对自体溶酶体的成熟是一个高度规范的过程。在酵母中最初鉴定的AuTophaGy相关（ATG）基因是泛蛋白样蛋白Atg8，其通过与位于受体自噬体中的磷脂磷脂酰乙醇胺（PE）的可逆缀合以高度局部化的方式发挥其功能。人类细胞含有六个ATG8家族成员，可以分为两个亚科：i）微管相关蛋白1A / ...
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