| Fluorophore Labeling, Nanodisc Reconstitution and Single-molecule Observation of a G Protein-coupled Receptor
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] Activation of G protein-coupled receptors (GPCRs) by agonist ligands is mediated by a transition from an inactive to active receptor conformation. We describe a novel single-molecule assay that monitors activation-linked conformational transitions in individual GPCR molecules in real-time. The receptor is site-specifically labeled with a Cy3 fluorescence probe at the end of trans-membrane helix 6 and reconstituted in phospholipid nanodiscs tethered to a microscope slide. Individual receptor molecules are then monitored over time by single-molecule total internal reflection fluorescence microscopy, revealing spontaneous transitions between inactive and active-like conformations. The assay provides information on the equilibrium distribution of inactive and active receptor conformations and ...
[摘要] 通过激动剂配体激活G蛋白偶联受体（GPCR）是通过从无活性受体构象向活性受体构象的转变来介导的。我们描述了一种新颖的单分子测定法，可以实时监测单个GPCR分子中的激活连锁构象转换。受体在跨膜螺旋6末端用Cy3荧光探针进行位点特异性标记，并在连接到显微镜载玻片的磷脂纳米圆盘中重构。然后通过单分子全内反射荧光显微镜随时间监测单个受体分子，显示无活性和活性样构象之间的自发转变。该测定提供关于无活性和活性受体构象的平衡分布以及构象交换的速率常数的信息。实验可以在不存在配体的情况下进行，显示负责基础信号传导活动的自发构象过渡，或者存在激动剂或反向激动剂配体，揭示配体如何改变受体的动力学刺激或抑制信号传导活性。所得到的机械信息对于改进的GPCR靶向药物的设计是有用的。单分子测定法在β2肾上腺素能受体的背景下进行了描述，但可扩展到多种GPCRs。
【背景】GPCR介导本地和远距离的细胞通讯，特别是内分泌系统。例如，细胞对激素如肾上腺素的反应是通过肾上腺素能受体介导的，其中β2肾上腺素能受体（β2AR）是突出的成员。 ...
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| Chromatin Immunoprecipitation Experiments from Whole Drosophila Embryos or Larval Imaginal Discs
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Author:
Date:
2017-06-05
[Abstract] Chromatin Immunoprecipitation coupled either to qPCR (qChIP) or high-throughput sequencing (ChIP-Seq) has been extensively used in the last decades to identify the DNA binding sites of transcription factors or the localization of various histone marks along the genome. The ChIP experiment generally includes 7 steps: collection of biological samples (A), cross-linking proteins to DNA (B), chromatin isolation and fragmentation by sonication (C), sonication test (D), immunoprecipitation with antibodies against the protein or the histone mark of interest (E), DNA recovery (E), identification of factor-associated DNA sequences by PCR or sequencing (F). The protocol described here can readily be used for ChIP-seq and ChIP-qPCR experiments. The entire procedure, describing experimental setup ...
[摘要] 与qPCR（qChIP）或高通量测序（ChIP-Seq）相结合的染色质免疫沉淀已被广泛用于识别转录因子的DNA结合位点或基因组中各种组蛋白标记的定位。 ChIP实验通常包括7个步骤：收集生物样品（A），交联蛋白质到DNA（B），染色质分离和通过超声处理分离（C），超声处理测试（D），用针对蛋白质的抗体进行免疫沉淀感兴趣的组蛋白标记（E），DNA回收（E），通过PCR或测序鉴定因子相关DNA序列（F）。这里描述的协议可以容易地用于ChIP-seq和ChIP-qPCR实验。描述在完整的果蝇组织中优化分析的实验设置条件的整个过程可以在四天内完成。
背景 尽管永生化的培养细胞广泛用于研究各种细胞类型的染色质景观，但是在生理条件下在体内探测相互作用的有价值的方法对于进行转录的时间或空间比较分析是必要的因子和组蛋白修饰图在不同阶段的果蝇发展或不同组织之间。在这里，我们提供了一个详细的ChIP协议，已被优化，以便在整个果蝇胚胎和幼虫成像光盘上工作，突出关键的实验参数。
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| Ultradeep Pyrosequencing of Hepatitis C Virus to Define Evolutionary Phenotypes
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Author:
Date:
2017-05-20
[Abstract] Analysis of hypervariable regions (HVR) using pyrosequencing techniques is hampered by the ability of error correction algorithms to account for the heterogeneity of the variants present. Analysis of between-sample fluctuations to virome sub-populations, and detection of low frequency variants, are unreliable through the application of arbitrary frequency cut offs. Cumulatively this leads to an underestimation of genetic diversity. In the following technique we describe the analysis of Hepatitis C virus (HCV) HVR1 which includes the E1/E2 glycoprotein gene junction. This procedure describes the evolution of HCV in a treatment naïve environment, from 10 samples collected over 10 years, using ultradeep pyrosequencing (UDPS) performed on the Roche GS FLX titanium platform (Palmer et al. ...
[摘要] 使用焦磷酸测序技术的高变区（HVR）分析受到纠错算法解释存在的变异异质性的能力的阻碍。通过应用任意频率切断，对样本间波动与色情子群体的分析以及低频变体的检测是不可靠的。累积地导致遗传多样性的低估。在以下技术中，我们描述了包含E1 / E2糖蛋白基因连接的丙型肝炎病毒（HCV）HVR1的分析。该程序描述了HCV在治疗初始环境中的演变，从10年来收集的10个样品中，使用在Roche GS FLX钛平台上进行的超深度焦磷酸测序（UDPS）（2014年，Palmer等人） 。使用血清样品的初步克隆分析来通知允许达到更大序列深度的下游误差校正算法。已经针对HCV基因型1,2,3和4测试了该区域的PCR扩增。
背景 衍生自病毒扩增子的UDPS数据集的分析经常依赖于未针对扩增子分析进行优化的软件工具，假设随机并入测序突变，并且集中在找到真实序列而不是假变异体。存在于RNA病毒基因组中的高变区存在这些困难。许多利用UDPS的研究通过对数据应用任意的频率切断来寻求解决这些问题，从而导致小的变体的丢失。在这里，暂时匹配的克隆数据集以及旨在克服所概述的问题的纠错方法，有助于保留有价值的序列信息。
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