| A One-enzyme RT-qPCR Assay for SARS-CoV-2, and Procedures for Reagent Production
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Author:
Date:
2021-01-20
[Abstract] Given the scale of the ongoing COVID-19 pandemic, the need for reliable, scalable testing, and the likelihood of reagent shortages, especially in resource-poor settings, we have developed an RT-qPCR assay that relies on an alternative to conventional viral reverse transcriptases, a thermostable reverse transcriptase/DNA polymerase (RTX) (Ellefson et al., 2016). Here we show that RTX performs comparably to the other assays sanctioned by the CDC and validated in kit format. We demonstrate two modes of RTX use – (i) dye-based RT-qPCR assays that require only RTX polymerase, and (ii) TaqMan RT-qPCR assays that use a combination of RTX and Taq DNA polymerases (as the RTX exonuclease does not degrade a TaqMan probe). We also provide straightforward recipes for the purification of this ...
[摘要] [摘要]鉴于持续进行的COVID-19大流行的规模，可靠，可扩展的测试需求以及试剂短缺的可能性（尤其是在资源匮乏的环境中），我们开发了一种n RT-qPCR分析方法，该方法依赖于其他方法与常规病毒逆转录酶相比，热稳定的逆转录酶/ DNA聚合酶（RTX）（Ellefson等，2016）。在这里，我们显示RTX与CDC认可并以试剂盒形式验证的其他检测方法具有可比性。我们演示了两种RTX使用模式-（i）仅需要RTX聚合酶的基于染料的RT-qPCR分析，以及（ii）使用RTX和Taq DNA聚合酶组合的TaqMan RT-qPCR分析（因为RTX核酸外切酶不降级ea TaqMan探针）。我们还提供了纯化该替代试剂RTX的简单方法。我们预计，在资源匮乏或需要的地方，研究人员可以获取可用的构建体，并开始开发自己的测定方法，而不论它们存在的调控框架如何。
[背景]尽管已采用多种病毒检测方法来检测SARS-CoV-2感染，包括各种分子诊断和免疫诊断测试，但逆转录酶定量聚合酶链反应（RT-qPCR）仍然是主要且最敏感的方法SARS-CoV-2检测试验（D'Cruz等，2020 ; Tang等，2020 ）。RT-qPCR的首要地位在很大程度上是因为基于抗体的测试以及快速核酸诊断平台（如Abbott ...
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| Preparation of Cerebellum Granule Neurons from Mouse or Rat Pups and Evaluation of Clostridial Neurotoxin Activity and Their Inhibitors by Western Blot and Immunohistochemistry
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Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] Cerebellar Granule Neurons (CGN) from post-natal rodents have been widely used as a model to study neuronal development, physiology and pathology. CGN cultured in vitro maintain the same features displayed in vivo by mature cerebellar granule cells, including the development of a dense neuritic network, neuronal activity, neurotransmitter release and the expression of neuronal protein markers. Moreover, CGN represent a convenient model for the study of Clostridial Neurotoxins (CNT), most notably known as Tetanus and Botulinum neurotoxins, as they abundantly express both CNT receptors and intraneuronal substrates, i.e., Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor activating protein receptors (SNARE proteins). Here, we describe a protocol for obtaining a highly pure ...
[摘要] 来自产后啮齿动物的小脑颗粒神经元（CGN）已被广泛用作研究神经元发育，生理学和病理学的模型。 CGN体外培养维持成熟小脑颗粒细胞在体内显示的相同特征，包括发育致密的神经炎网络，神经元活动，神经递质释放和神经元的表达 蛋白质标记。 此外，CGN代表了梭菌神经毒素（CNT）研究的便利模型，最着名的是破伤风和肉毒杆菌神经毒素，因为它们大量表达CNT受体和神经元内基质， ie ，可溶性N-乙基马来酰亚胺 - 敏感因子激活蛋白受体（SNARE蛋白）。 在这里，我们描述了从出生后大鼠/小鼠获得高纯度CGN培养物的方案和用CNT中毒的简便方法。 我们还说明了评估CNT活性及其抑制的方便方法。
【背景】梭菌神经毒素（CNT）的大家族由破伤风神经毒素（TeNT）和肉毒杆菌神经毒素（BoNT）的多种变体形成，它们分别是破伤风和肉毒中毒的神经麻痹毒素（Schiavo et al。，2000; Johnson和Montecucco，2008; Rossetto et al。，2014）。 TeNT，七种BoNT血清型（BoNT / A至/ G）及其许多亚型是金属蛋白酶，通过切割SNARE蛋白（可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子激活蛋白受体），三种必需蛋白质来阻断神经递质的释放而引起神经麻痹。控制突触小泡与突触前质膜的融合（Rossetto et al。，2014; ...
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| Guanine Nucleotide Exchange Assay Using Fluorescent MANT-GDP
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] GTPases are molecular switches that cycle between the inactive GDP-bound state and the active GTP-bound state. GTPases exchange nucleotides either by its intrinsic nucleotide exchange or by interaction with guanine nucleotide exchange factors (GEFs). Monitoring the nucleotide exchange in vitro, together with reconstitution of direct interactions with regulatory proteins, provides key insights into how a GTPase is activated. In this protocol, we describe core methods to monitor nucleotide exchange using fluorescent N-Methylanthraniloyl (MANT)-guanine nucleotide.
[摘要] GTP酶是分子开关，在无效GDP结合状态和活性GTP结合状态之间循环。 GTP酶通过其内在的核苷酸交换或通过与鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）的相互作用来交换核苷酸。 监测体外核苷酸交换，以及与调节蛋白直接相互作用的重构，为GTP酶如何被激活提供了重要见解。 在该协议中，我们描述了使用荧光N-甲基呋喃酰基（MANT） - 鸟嘌呤核苷酸来监测核苷酸交换的核心方法。
【背景】GTPase是鸟嘌呤核苷酸结合蛋白，调节细胞过程的广度，从蛋白质生物合成到细胞周期进展，从细胞骨架重组到膜运输。 GTPases可以被认为是分子开关，它在GDP结合“关闭”状态和GTP结合“开启”状态之间循环;在通过GTP的GDP核苷酸交换结合GTP时，GTP酶变得活跃并且将结合下游效应蛋白以招募和激活这些效应子的生物学功能。 GTP酶通过与开关I环（G2结构域）的高度保守苏氨酸和开关II环（G3结构域）的DxxG基序内的甘氨酸的相互作用结合GTP的γ-磷酸。 GTP水解后，与γ-磷酸相互作用的丧失导致动态构象变化，从而使GTPase变为关闭状态（Vetter and ...
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